1材料与仪器
1.1动物
SD大鼠，70只，SPF级，雌雄各半，180g左右，合格证号：0012625，由广州中医药大学实验动物中心提供。
1.2试剂
卵白蛋白批号：970612上海化学试剂公司；氢氧化铝干粉批号：20020301-2广州化学试剂厂；灭活百日咳杆菌（100亿个/ml）广东省中医院提供；大鼠IL-4（批号20060620）、IFN-γ（批号20060620）ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司提供；IL-5（批号20983008）ELISA试剂盒由BanderMedsystems提供。
1.3补骨脂不同溶剂提取物补骨脂95%乙醇提取物浸膏，浓度：3.45g药材/ml（简称浸膏）；补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物，浓度：10.0g药材/ml（简称石油醚萃取物）；补骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物，浓度：6.67g药材/ml（简称醋酸乙酯萃取物）；补骨脂95%乙醇提取水萃取物，浓度：10.0g药材/ml（水萃取物）；补骨脂水提取物，浓度：10.0g药材/ml（简称水提取物）；补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物，浓度：2g药材/ml（简称甲醇洗脱物），以上试剂均由广州中医药大学中药学院提供。
1.4仪器酶标仪BIO-RADSModel550，日本；CSW-Ⅰ型超声雾化器汕头光电研究所；10L玻璃干燥器。
2方法
2.1分组
将动物随机分成7组，10只/组：哮喘模型组（给水，1.0ml/100g）、浸膏组（药材0.9g/100g）、石油醚萃取物组（药材2.5g/100g）、醋酸乙酯萃取物组（药材1.7g/100g）、水萃取物组（药材2.5g/100g）、水提取物组（药材10.0g/100g）、甲醇洗脱物组（药材2.5g/100g）。以上各组动物连续灌胃给药治疗10次，1次/d。末次治疗后2h，各组动物心脏采血5ml，1000r/min离心15min，血清分装（1ml/管）保存于－70℃低温冰箱内待测：IL-4，IFN-γ，IL-5（严格按照ELISA试剂盒说明书分别检测）。
2.2卵蛋白哮喘大鼠模型的建立
2.2.1大鼠致敏
上述分组中每只动物腹腔注射抗原液0.5ml/100g(含卵蛋白100mg、氢氧化铝干粉100mg和2.5×109个百日咳杆菌/ml,制成悬浊液)［7］致敏第1次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加强。
2.2.2激发和治疗
首次致敏后第15天，于每天上午8～9时大鼠置于10L玻璃干燥器内超声雾化吸入2%卵蛋白20min激发哮喘,连续14d。激发后第4天起，于每天激发后大鼠口服给相应试剂治疗（见“2.1实验分组”）。正常组以生理盐水取代抗原液按0.5ml/100g腹腔注射致敏大鼠，第2天以0.5ml/只腹腔注射生理盐水加强；首次致敏后第15天，每天上午8～9时该组大鼠超声雾化吸入生理盐水20min激发哮喘,连续14d。激发后第4天起，于每天激发后大鼠口服给蒸馏水治疗。
2.3统计分析结果
采用四川大学黄志勇主编的（PEMS3.0）《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包进行统计：两组均数比较t检验（方差齐）或t′（方差不齐）。
3结果
3.1补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-5含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清IL-5含量呈下降趋势，其中补骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脱物各成分组大鼠血清IL-5含量降低明显，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，差异有显著意义。而石油醚和醋酸乙酯萃取物两成分组大鼠血清il-5含量降低不明显，与哮喘模型组比较p>0.05，无显著性差异。
3.2补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-4含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清IL-4含量呈升高趋势，其中补骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分组大鼠血清IL-4含量升高明显，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清il-4含量升高不明显，与哮喘模型组比较p>0.05，无显著性差异。
3.3补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IFN-γ含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，不同溶剂成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致，其中补骨脂浸膏和石油醚萃取物两成分组大鼠血清IFN-γ含量升高明显，与哮喘模型组比较P<0.05，差异有显著意义。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清IFN-γ含量减低显著，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，有显著性差异，而补骨脂水提对ifn-γ含量未见明显影响，与哮喘模型组比较p>0.05，无显著性差异。表1不同提取物对哮喘大鼠IL-5，IL-4，IFN-γ含量的影响(略)
3.4补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠Th1/Th2（IFN-γ/IL-5）的影响哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取组、甲醇洗脱物组和水提取物组的Th1/Th2比值依次为（n=10)：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5，0.8±0.4和1.2±0.5。提示，大鼠服用补骨脂醇提上述4种溶剂萃取物后，血清Th1/Th2比值呈增加明显，与哮喘模型组比较P<0.05，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物（0.4±0.2，n=10）和水萃取物（0.6±0.2，n=10）两成分组大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明显，与哮喘模型组比较P＞0.05，无显著性差异。
4讨论
哮喘与Th1细胞分泌的IFN-γ等细胞因子及Th2细胞产生的IL-4，IL-5等细胞因子含量和Th1/Th2比值密切相关。Th2的主要代表产物IL-4，能促进B细胞产生IgE，引发炎症介质释放的链式反应，促进炎症细胞的趋化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水肿，平滑肌痉挛及粘液分泌亢进，是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表产物是IFN-γ，能抑制IL-4，IL-5等细胞因子的产生，进而抑制IgE的产生和Eos活性，抑制IAR和LAR，是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子，许多细胞因子通过它发挥生物效应［8］。因此，采用IFN-γ，IL-5，IL-4作为哮喘敏感指标进行药物筛选具有合理性。补骨脂是临床上常用的补肾助阳中药，具平喘之功，临床上常用于虚寒喘咳［9］。补骨脂是今后应加强研究和开发的抗气道抗炎症中药之一［2］。我院从20世纪80年代初使用补骨脂注射液治疗支气管哮喘取得了理想的疗效，但其作用的物质基础并不清楚。因此，我们在前期研究的基础上［2，3］，采用卵蛋白哮喘大鼠为模型，以体内血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量变化为指标，初步筛选补骨脂平喘作用的有效部位。
从IFN-γ含量变化来看，补骨脂95%乙醇提取物浸膏和补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明显，可能是补骨脂平喘的主要成分，但从抑制IL-5和IL-4含量分析，补骨脂95%乙醇提取水萃取物和补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物对Th2细胞产生的IL-4，IL-5细胞因子有较强的抑制作用，其他成分却升高或对IL-5，IL-4没有显著影响，而补骨脂水提取物对IFN-γ含量提高作用不明显。另外，补骨脂95%醇提水萃取物显著降低IL-5和IFN-γ含量，同时在给药的过程中我们发现水萃取物的毒性明显强于其他成分，这与其肾毒性是否相关值得关注。根据以上分析，我们初步推测补骨脂平喘有效部位应该主要是醇提成分：补骨脂95%乙醇提取物浸膏，补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脱物。
从哮喘中考察Th1/Th2的比值变化更具有意义［10］，因此我们以IFN-γ/IL-5为例，分析Th1/Th2的变化，探讨补骨脂3个醇提成分（浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脱物）哪个为平喘的最佳有效部位。哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取物组和甲醇洗脱物组的Th1/Th2依次为（n=10）：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5和0.8±0.4，与哮喘组比较三者的P<0.05，差异有显著意义，但醇提浸膏的比值更大。因此结合前面的分析，我们认为三者的平喘作用大小依次为：补骨脂95%乙醇提取物浸膏>补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物=补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。
【参考文献】
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［2］钟南山.未来十年哮喘防治展望［J］.实用医学杂志，2001，17（6）：471.
［3］谭慧淇．补骨脂注射液对支气管哮喘平喘作用的动物实验和临床观察［J］.广东医学，1984，11：29.
［4］邓时贵，李爱群，欧润妹，等.补骨脂总香豆素的平喘作用［J］.中国现代应用药学杂志，2001，18（6）：439.
［5］邓时贵，区勇全，李爱群，等.补骨脂中黑色粘稠物鼻腔给药的止喘作用［J］.西北药学杂志，2000，15（5）：211.
［6］邓时贵，李伟英，韩凌.总香豆素抗支气管哮喘气道变应性炎症的作用机制［J］.中国新药杂志，2006，15（9）：24.
［7］童舜华，吴敦序，陈淑俊，等.小青龙汤对哮喘大鼠气道阻力、肺动态顺应性和血嗜酸细胞数的影响［J］.中国中医药科技，1999,6(2)：79.
［8］BarnesPJ.Effeckofnedocromilsodiumorplatet-activatingfactorinducedairwayresponses［J］.JAllergyClinImmunol,1993,92:187.
［9］柴瑞霁.温肾助阳化痰饮，摄纳肾气平喘咳-补骨脂治疗虚寒喘咳的体会［J］.山西中医，1997，13（4）：49.
［10］邓时贵，韩凌，李伟英.总香豆素对卵蛋白致敏哮喘大鼠血清Th1/Th2的影响［J］.中国现代实用医学杂志，2005，4(8)：1.
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