《微生物》课程实习报告 102255005014
动物科学学院课程实习报告
报告题目菌种的冷冻干燥保藏法
课程名称水产微生物学实习地点动物科学学院水产病害实验室实习时间201*.12.24－12.28专业年级水产养殖201*级学生姓名许剑峰学号102255005014
指导老师
林旋讲师
同组成员：吴超、张艺端、张行、许剑峰、钟春清、林晶、陈冬安一、实习目的和要求
1、目的
通过实习使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。通过实习，掌握培养基的配制、分装及灭菌方法；掌握微生物的接种技术；掌握微生物的冷冻干燥保藏方法。2、要求
（1）注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；
（2）课程实习前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；
（3）在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；（4）树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密切配合。
二、实习内容
1、培养基的配制和灭菌。2、微生物（金葡菌）的接种。
3、菌种的（金葡菌）的冷冻干燥保藏方法。4、日程安排：
第一天实习课程的讲授；实习工具、仪器和设备的准备（包括培养基的配制、倒平板、金葡菌的活化、保护剂的配制）。
第二天金葡菌由固体培养基转接至液体培养基；准备第三天的实验器具。第三天菌种冻干前的预处理。第四天菌种的冻干操作。第五天冻干机关机，菌种保藏。
三、主要材料和仪器设备
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液枪、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、剪刀、酒精灯、硅胶塞、线绳、报
纸、乳胶管、电炉、高压灭菌锅、干燥箱、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、金葡菌斜面培养物、接种环、冻干机、西林瓶、离心机、生化培养箱等。
四、操作方法
1.制备培养基
2.配制保护剂：鲜牛奶3000r/min离心30min，弃去上层脂肪，加9倍体积生理盐水，分装，121℃(或116℃)高压灭菌20min后备用。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。
3.包2根离心管、4根大枪头、2个西林瓶、1根8ml生理盐水、1根保护剂，121℃灭菌20min。
4.把菌种从平板培养物接种至平板培养基（菌种的活化）：（1）把接种环放在酒精灯上消毒，消毒时应使接种环完全烧红；（2）待接种环冷却后，用接种环从平板上沾取少许菌苔；（3）然后用接种环在平板培养基上画线；（4）把平板培养基拿去37℃培养24h
5.把菌种从平板培养物接种至液体培养基（液体接种法）：（1）用接种环从平板上沾取少许菌苔；（2）在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次；（3）将液体肉汤培养基150r/min摇床37℃培养24h。
接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。6.把灭菌物品烘干备用
7.拿出液体培养基：取出5ml菌液放入无菌离心管4000r/min离心20min，倾去上清液，再用5ml无菌生理盐水将菌泥重新悬浮，再次4000r/min离心20min，倾去上清液，用5ml灭菌保护剂将菌泥重新悬浮，之后就可以分装入西林瓶，每瓶1ml(液面高度3～5mm)。
8.预冻：分装好的菌种管放－80℃预冻2h，同时开启冻干机的制冷机，也可在冻干机的冷阱中预冻菌种。
9.冻干：当冻干机冷阱温度达到－40℃时，将预冻好的西林瓶放进压盖干燥架中，
把假盖板放在冷阱上，再将干燥架放在冷阱上方，罩上压盖有机玻璃罩，罩下端要与“O”型密封圈完全接触。顺时针拧紧真空阀，按“真空计”键，显示真空度为100～110×103，再按“真空泵”键，真空泵工作（真空泵的盖子要打开），15Pa以下为正常，冻干开始。10.压盖：24h后，视感物料已完全干燥，按顺时针方向转动有机玻璃罩上方手柄，使罩中压盖架丝杠转动下移，将瓶盖压入瓶中，实现在真空中压盖。
11.关机：按逆时针方向打开真空阀充气，按“真空泵”键，真空泵停止运转。取下有机玻璃罩，拿出西林瓶保存。
五、注意事项
1.需灭菌的物品应严格灭菌，避免污染杂菌；2.接种时应该要等接种环完全冷却后再接种；
3.冻干时，西林瓶的盖子一定要放好，即使西林瓶中的空气可以出来形成真空，又能在压盖的时候可以把盖子盖好。
六、实习结果
上图中盖子已经掉了的和西林瓶中还是液体的都是实验失败的，盖子即没掉瓶子中的菌种又是粉末状的为实验成功的。
盖子掉了的：是因为抽气时，气流流动使瓶子掉下来。
瓶子中还是液体的：是因为盖子盖的太紧，瓶中的空气抽不出来，水分也没抽出，导致瓶子中的菌种未变成粉末状。
七、实习总结或体会
通过这个实习，掌握了培养基的配制、分装及灭菌方法；掌握了微生物的接种技术；掌握了微生物的冷冻干燥保藏方法。通过实习将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，明白了需灭菌的物品应严格灭菌，避免污染杂。也让我的综合能力与创新意识得到了提高。
扩展阅读：生产实习报告
大四下学期刚开始，作为生物工程专业的学生，我们迎来了生产实习。我们已经在大三参观过青岛啤酒博物馆和我校的中试基地，在校期间我们学过《酶工程》、《生物化学》、《微生物》等基础课程，为此次生产实习打下了理论基础。我们在生产实习中，我们分别在青岛琅琊台股份有限公司、青岛啤酒股份有限公司和青岛灯塔酿造有限公司参观了实际生产流程。理论联系实际，让我们对所学知识有了是深刻的体会。
一、实习目的
生物工程专业通过掌握生物技术及其产业化的科学原理、工艺技术过程和工程设计等基础理论，基本技能，能在生物技术与工程领域从事设计生产管理和新技术研究、新产品开发的工程技术人才。而仅仅在实验室做实验远远不够的，生物技术的成果只有投入生产才是将知识化作生产力，推动社会的发展。在学校里积攒了基本的实验技能，又通过认识实习了解到中试的重要，作为完善该专业知识的重要一环，生产实习不可或缺。本次将通过参观的方式，了解啤酒，白酒，酱醋等不同发酵产品的生产异同。为以后走上工作岗位奠定基础。
二、实习单位
山东省胶南市山东青岛市琅琊台酒厂山东省青岛市山东青岛市灯塔调味品厂山东省青岛市山东青岛市青岛啤酒四厂三、实习安排时间2月24地点新教活动内容回顾酿造有关知识、明确实习安排、安全教育乘车前往胶南市了解琅琊台厂历史、参观传统酿造车间、参观半机械酿造车间2月252月26上午下午上青午岛琅琊台下股午份有限上公司午下午参观果酒制作工艺流程、白酒包装流程参观污水处理系统
2上月27午3月2青岛灯塔酿造有限公司青岛啤酒股份有限公司乘车返校了解厂史、参观发酵工艺、主要设备3月4了解厂史、参观发酵工艺、主要设备四、实习内容2-24
上午：在新教教室开动员大会。老师带我们回顾所学有关酿造课程知识，明确实习期间的安排，并对我们进行了安全教育。
下午：乘坐大巴来到胶南市，安排住宿。2-25
进入厂区后接待人员向我们介绍了琅琊台厂，青岛琅琊台集团股份有限公司于1958年建厂。其发展历史主要有四个阶段，设立之初为胶南市商业局酒厂，后历经勤劳的琅琊台造酒人多年的艰苦奋斗，规模逐步扩大，于1985年成为青岛第一酿酒厂，1994年创立青岛琅琊台酒业股份有限公司，1996年组建青岛琅琊台酒业（集团）股份有限公司，到201*年，发展成为大型企业集团青岛琅琊台集团股份有限公司。集团公司生产历史悠久，技术力量雄厚，下设青岛科海生物有限公司、青岛第一酿酒厂、青岛琅琊台酒销售有限公司、青岛加斯克尼酒业有限公司等13家子公司，是主要以生产白酒、果饮、生化等产品的现代化企业集团。公司已经通过ISO9001质量管理体系认证和ISO14001环境管理体系认证。青岛琅琊台集团是依托酒类产业发展起来的企业。酒类产业主导产品“琅琊台”牌白酒，深掘传统“老五甑”工艺，精耕细做，具备了“窖香浓郁、绵甜甘冽、落口爽净、回味悠长”等典型的浓香型白酒特点。值得关注的是苹果酒、苹果醋，近年来在集团各系列产品中异军突起，产生了巨大的效益。
随后我们参观了传统工艺的酿造车间。琅琊台酒厂所产白酒为浓香型大曲酒，浓香型大曲酒酿造工艺的基本特点是：以高粱为制酒原料，以优质小麦、大麦和豌豆等为制曲原料制得中、高温曲，泥窖固态发酵，续糟配料，混蒸混烧，
量质摘酒，原酒贮存，精心勾兑。其中最能体现浓香型大曲酒酿造工艺独特之处的是“泥窖固态发酵，续糟配料，混蒸混烧”。其工艺特点为：混蒸混糟、泥土老窖、万年糟（续糟）。
琅琊台酒场间歇式、开放式生产，并用多菌种混合发酵传统的固态法白酒生产，主要是手工操作，生产的主要环节除从原料蒸煮到灭菌的过程外，其他过程都是开放式的操作，各种微生物通过空气、水、工具、场地等渠道，进入酒醅，与曲中的微生物一同参与发酵，产生丰富的芳香成分。浓香型酒制曲用小麦、大麦、豌豆、高粱，但以小麦为主；采用中高温制曲，培菌温度高达５５～５８℃，有利于曲香的形成。混蒸续糟：粮粉与酒醅混合，蒸酒蒸粮同时进行（粮粉与母糟比为１∶４．５～５．５），母糟循环使用，故称“万年糟”。固态法酿酒，采用低温蒸煮、低温糖化发酵，而且糖化与发酵同时进行（即双边发酵），有利于多种微生物共酵和酶的共同作用，使微量成分更加丰富。
老五甑法投料时，有两个甑不投料。生产前3到5天，从窖池中抽黄水加新水，以便于降低原料中的水分，便于后续操作。投料时，主要依据看汽投料的方法。先在甑底部铺上一层稻壳，然后用工具尽量均匀的投料。装好后接上冷凝器，收集冷凝的酒。通过摘酒看酒中杂质，酒度测量等判读酒的质量和类别。当酒面上漂浮油花时为酒尾，单独收集后加入第二天的E级酒里继续蒸馏。每甑大约产50kg白酒。蒸馏完成后，将甑里的原料起出来，凉场排酸排杂，加入大曲或新料，继续投入窖池或进行下一步操作。窖池大小约为3*1.5*2（m^3），有一定坡度，便于控制水分、淀粉含量，要求厌氧环境，一般使用黑泥和黄土混合后密封。如果不能密封，将会产生烂池现象，酒液变质。老五甑法的原料一般是循环使用，机理如下：
下午参观了半机械生产车间，工艺流程图如下：
其工艺流程与传统车间基本相同，但是半机械花设备大大减少了人力劳力。2月26日
上午我们参观了果酒酿造制曲车间、以及琅琊台酒的包装流程。果酒酿造：
果酒生产车间的生产流程为（以苹果酒为例）：
制曲车间：
我们参观的是生产大曲的车间，为酿酒车间提供原料。其主要成分为：小麦70%、大米20%、豌豆10%，其中小麦和大米是用来提供碳源，豌豆是用来提供氮源。将原料粉碎为皮和面，五一之后开始生产。
主要设备：压曲机和拌面机
压曲机：可制作平板和包包两种，操作的关键是控制温度，最高温度为62度。温度曲线应该是前部分缓，中间部分长，后部分缓。
制曲过程：
在房间地面泼一些水，保持湿度。降曲砖排列在地上。
稻壳、席子、水→盖湿席、湿草→关门窗（5天，温度27度-30/33度）→取席子、草，开窗（湿度90%）晾曲（提高表面硬度）
两层以后并房，升高温度，禁止出现穿堂风，不利于内部水分排除。曲砖：
规格：15cm*7cm
包装车间：包装流程如图：
下午我们参观了污水处理系统
工厂的污水治理循环可以日处理污水1700吨，使污水中的COD（化学需氧量）下降至100mg/L，经处理后的废水不但能够补充工业循环用水，还可以用来养鱼浇花，成功实现了中水回收。开创出一条经济效益、生态效益双赢的典范之路。该项目采用国际先进的环保技术，选用“混凝沉淀+两相厌氧（EGSB+UASB）+接触氧化”为主体的水处理工艺，建立DCS自控系统，利用生物处理技术体现项目的绿色环保和实用经济性。此外，该项目的生产工艺采用全封闭式，酒糟废液通过管道输送全部入池，减少了蚊蝇的滋生，通过厌氧、好氧、物化等工艺，消除了各种寄生虫、卵，沼气直接供锅炉燃烧，净化了空气，减少了污染，同时通过发电机组进行发电，为公司提供电力或向电网输送，是一项把废物处理与制取新能源、改善环境条件、发展生产结合为一体的系统工程。
3月2日
我们青岛灯塔酿造有限公司进行了参观。
灯塔集团有百年历史，经历了由私企→国企→私企的变化，以生产酱油和醋为主。青岛灯塔酿造有限公司是山东省最大的国有调味品专业生产经营企业，公司于1904年建厂，是被国内贸易部命名的“中华老字号”之一。总公司由所属第一、第二酿造厂、天嘉食品有限公司及营销分公司等7个企业组成，选用优质原料酿造，酱油采用高盐稀态发酵和低盐固态发酵工艺，酱酯醇厚；食醋采用先稀后固传统酿造工艺和液态深层发酵新工艺，醇香浓郁，澄清度高，营养丰富。主要生产经营“灯塔牌”酿造酱油、酿造食醋及酱菜、酱类、各种调味品及豆制品共六大类上百个品种。
生产过程中，从原材料进厂、发酵直到产品包装入库，都经过先进检测设备监控和严格把关，确保每一瓶产品的品质和食品卫生，使消费者得到品质优良的放心产品
酱油酿造：
生产分为：1、低盐固态发酵2、低盐固态回浇发酵3、高盐发酵1、低盐固态发酵：
生产周期短，发酵快（最快在十天左右），主要用于90年代以前缺点：生产风味欠佳2、低盐固态回浇发酵
生产周期大于低盐固态发酵（一个月），产品均衡，风味优良，出品率稍高，成本高。
上层温度高，易挥发，产生焦糊味。本方法可消除焦糊味，且对原料的利用率高
3、高盐发酵
现在大部分企业用此方法，其特点为：投资大，发酵过程需要控温，最有效地保持原有风味，产品质量大于前两种方法所出产品，周期较长。
本厂采用的是后两种酿造方法，其中以第二种方法为主，部分高档产品采用第三种方法。
食醋的酿造：
酿造方法：1、固态发酵2、液态深层发酵1、固态发酵
此方法为传统生产方式，用淀粉质、糖质、酒精质原料进行发酵。发酵过程：
高温蒸煮（高粱、大米+糠皮、麸皮）→入池→封池（通过微生物酒精发酵）→翻料（缴入氧气，醋发酵）→淋醋→原汁→配比（半成品）→灭菌→沉淀→包装
2、液态深层发酵
该发酵方法引进国家20多年，该厂90年代引进设备特点：品味清单，醋味带有甜味，不会改变菜得味道，颜色工艺流程：
1、液化将原料进行筛选、水洗、浸泡、磨浆、液化2、糖化加入糖化酶，糖制剂，将原料转变为一糖质为主3、酒精发酵糖化原料→酒
4、醋话酒精状态进一步氧化，醋酸菌作用进行醋酸氧化比较：
1、固态发酵：利用自然界微生物发酵（多菌种发酵）若控制不当则后期产物难以控制。
2、液态发酵：每个过程都是纯菌种发酵3月4号
我们在青啤四厂进行了参观
青岛啤酒四厂全称青岛啤酒股份有限公司青岛啤酒四厂，于1990年10月设立，位于青岛市李沧区永平路6号，占地面积为59178平方米，地处济青高速公路和沿海高速公路交汇处，濒临铁路、港口、交通十分便利。该厂占地百余亩，其前身为始建于1923年的青岛酒精厂。
1949年6月青岛解放后，日华酿造株式会社由青岛烟酒管理局接管，并更名为沧口酒厂，隶属山东省专卖事业公司领导。
1951年，青岛实业公司租赁华北酒精厂的设备和厂房，也开工生产酒精，
并定厂名为青岛实业酒精厂,属实业公司领导。
1953年，正式生产酒精产品，归属青岛实业公司，更名为青岛实业酒厂。1957年试制成功62度兑制白酒，注册“栈桥”牌，通称“栈桥”白干，分瓶装和散装两种。1963年，“栈桥”白干被山东省评为地方名酒，产量达到201*吨。1975年，试制成功清泉液，使两步发酵白酒新工艺达到国内先进水平。1963年,“栈桥”白干被山东省评为地方名酒。1980年，又酿制成功“淘米春”和“酥糜浓酿”浓香型白酒。1982年获山东省科委颁发的科研成果三等奖。
1958年3月1日，青岛实业酒精厂和青岛实业酒厂合并，定名为青岛酒精厂,迁至沧口区柳林路1号，现永平路6号。时有蒸煮锅6口，糖化锅4口，发酵池17个,蒸馏塔2套，当年产酒精10吨，次年上升到36吨。
1985年达到1.3万吨，并在山东省酒精评比会上评为优质产品，总分名列全省第一。拥有职工1024人，固定资产原值1167万元，净值520.8万元，流动资金684.17万元，创产值1974.26万元,实现利润319万元。并生产汇泉啤酒。
1990年11月22日划归青岛啤酒公司，1991年4月6日更名为青岛啤酒四厂。
1993年，青岛啤酒成立股份公司。
1999年10月份开始的四厂扩建，201*年7月份工程基本完工。酿造原料：
大麦：麦芽为主要原料
辅料：①未经发芽的谷物，如大米、玉米、小麦等，在糖化时的使用比例为20%-30%，他们的浸出物可以通过麦芽中的酶或者酶制剂分解成课发酵性糖
②发酵所需的糖类物质，如蔗糖、糖浆等，他们是在麦汁制备过程中直接加到麦汁里的，一增加麦汁中课发酵性糖的量，糖类物质的使用量一般为10%-20%
酒花：提就酿造通常用雌花。其主要作用是赋予必究爽口的苦味和酒花香味、促进麦汁和啤酒的澄清、有利于啤酒的泡沫、作为啤酒的防腐剂。
水：啤酒厂的水处理主要有三部分①酿造用水，处理这部分水主要是去硬和酸度改良②酵母洗涤用水，需要除菌，否则会造成酵醪污染③稀
释用水，这部分水用于高浓酿造稀释，水处理要求比较严格，出了去硬和杀菌外，还要除氧和二氧化碳。
工艺流程：采用三灌两槽
糊化锅→糖化锅→过滤槽→煮沸锅→澄清槽
麦汁冷却一般采用薄板换热器，发酵过程由电脑控制温度包装流程：
洗瓶→验瓶→装酒→压盖→灭菌→验酒→贴标→装箱污水处理：
青啤四厂结合污水站现有工艺和运行状况，确定污水站扩建的主要任务：工程上扩大现有的规模，购置设备，增加化验室，配备相应人员。工艺上一是降低废水的CODcr、BOD5和SS；二是去除总氮和总磷；三是消毒杀菌。实现污水一级A标准直接排放，从环境效益和社会效益将实现“双赢”。（1）环境效益：排放污水COD浓度下降到十分之一，年减少COD排放量千吨，年减少氨氮排放量数十吨。（2）社会效益：每年可提供两百余万吨景观用水，也可用于绿化、养鱼、一般刷洗。
五、实习总结
本次实习参观过了白酒、啤酒、食醋、酱油生产工艺，学习其酿造原理，对曾在课堂上所学的酿造知识有了深刻直观的进一步学习。从理论到实际，学习到了现实生产过程的复杂。其中白酒酿造过程中的“老五甑”是平时课堂学习中了解较少的知识，生产产品时不能过于教条，要分析实际情况，遵循一些前辈的经验。
所参观过的酱油和食醋的酿造方法是比较普遍的酿造方法，根据不同的口味、不同档次的产品采用不用的酿造方法。是产品多元化，适应更多消费人群
青啤四厂车间内设备先进，大部分都是采用机械化电子控制，能准确的进行添加物料，温度控制等操作。
通过这次实习我对实际生产的知识收获很大，对未来走向工作岗位有了一些知识准备。
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《《微生物》课程实习报告 102255005014》
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