《生物化学实验》教学大纲07应化
《生物化学实验》教学大纲
课程代码：
课程名称:生物化学实验课程类别：职业技能培训类修习类别：必修实验学分：1学分实验学时：36学时先修课程：生物化学授课对象：应用化学
承担实验室：实验楼B508生物化学实验室
一、教学目标
生物化学实验的方法和技术是生物科学以及其他相关研究领域中的一个非常重要和强有力的工具。通过生物化学实验这门课程的学习，能使学生掌握生物化学实验的基本操作及实验技术，掌握生物大分子的分离纯化、定性、定量、化学性质、生物活性的鉴定，掌握和了解组织代谢和能量释放转变和贮存与代谢调节过程中的代谢产物和间产物的定性、定量分析鉴定实验；学生分析问题和解决问题的能力及实验动手能力将得到训练，并能熟练掌握各种生物化学实验仪器的使用以及准确详实记录实验现象和数据的技能。
二、实验课程基本理论
本门实验课程以生物化学理论课为基础，在此基础上使学生能够熟练掌握各种常规的实验仪器。
三、实验方式及基本要求
为达到教学目的，实验指导教师对学生实验应进行的指导：
1、实验方式：教师讲解实验过程及相关注意事项，学生自己动手操作，教师全程指导。2、预习要求：应与理论课所学习的相应部分相结合，初步了解实验原理和反应过程等。3、实验操作方面要求：应做到规范、到位，及时观察与记录实验现象和数据，并特别强调
注意事项中设计的操作，弄清每一步实验操作的设计依据，并深入理解实验原理和反应过程等。
4、实验报告要求：应详细写出实验原理、操作步骤、实验现象、注意事项，并解答实验中
要求完成的计算等题目，必要时要总结实验成功的收获或失败的教训。
四、教学内容及学时分配
序号实验项目实验学时4实验类型演示性实验内容提要介绍并安排常规玻璃器皿、离心管等实验仪器的洗涤要求1仪器使用方法与器皿洗涤2蛋白质含量的测定3氨基酸的呈色反应、蛋白质的变性、沉淀和PI测定66综合性实验验证性实验从小白菜中叶片提取液中测定蛋白质含量，采用福林酚法和考马斯亮蓝G-250法通过双缩脲反应、茚三酮证明氨基酸的颜色反应，采用重金属、加热、调节pH值等方式验证蛋白质的变性、复性、沉淀等性质并测定其PI。采用微量凯氏定氮法测定鸡蛋清的含氮量，从而测定鸡蛋清中蛋白质的含量。分别测定水果和淀粉中还原糖和总糖的含量并进行比较。采样稀释的唾液淀粉酶，通过温度、pH值等的变化显示其对酶的活性的影响。4生物物质含氮量的测定5还原糖和总糖的测定6DNA的Tm值测定温度、pH值对酶活性的影响7考试6662设计性实验综合性实验验证性实验
五、考核方式及成绩评定
本门课程采用考查方式，各次实验报告平均分占总成绩的70％，实验操作、考勤、卫生值日等占30％。
六、配套教材或指导书
采用自编教材，参考书目如下：
1.《生物化学实验（第一版）》，陈曾燮等主编，中国科学技术大学出版社，1994年1月2.《生物化学实验指导（第一版）》，余冰宾主编，清华大学出版社，201*年1月3.《生物化学技术原理及其应用（第二版）》，赵永芳编著，武汉大学出版社，1994年6月
执笔：唐红枫审阅：
扩展阅读：生物化学实验教学大纲201*
《生物化学》实验教学大纲201*
1、课程属性：必修2、实验属性：非独立设课3、学时学分：实验学时224、实验应开学期：秋季
5、先修课程：有机化学、分析化学、普通化学
一、课程的性质与任务
生物化学实验课是在学习生物化学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对生物化学课程中基本理论知识的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、实验数据的处理和分析能力。
二、实验目的与基本要求
本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握和运用学过的基本理论；运用生物化学理论分析实验过程中的各种现象和问题，培养、训练学生的分析和解决问题的能力。
学生必须完成的基本要求：准备实验，预习实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。
三、实验考核方式及办法
考核方式：考查；实验成绩占总成绩的30%，实验成绩评分办法：实验操作占40%，实验态度占20%，实验报告占40%。
四、实验项目一览表
生物化学实验项目一览表
序号
1234567
血清球蛋白的分离--分子筛凝胶层析法醋酸纤维薄膜电泳法分离动物血清蛋白质血清乳酸脱氢酶同工酶的分离与测定动物肝脏DNA的提取紫外吸收法测定核酸含量
应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用维生素C含量的测定
验证性验证性综合性验证性综合性综合性综合性
必做必做必做必做必做必做必做
农科类农科类农科类农科类农科类农科类农科类
4333333
实验项目名称
实验类型
实验要求
适用专业
学时五、实验项目的具体内容
实验一血清球蛋白的分离------分子筛凝胶层析法
1、本次实验的目的和要求
学习和掌握分子凝胶层析法的原理和技术（溶胀，装柱，加样和洗脱），了解葡聚糖凝胶的选用原则2、实验内容或原理
分子筛指的是一些多孔介质。当含有不同大小分子的混合物流经这一介质时，小分子的物质能进入介质的孔隙，而大分子的物质则被排阻在介质之外，从而达到分离的目的，这种作用称为"分子筛效应”。当用含有硫酸铵和球蛋白的混合物进行上样时，球蛋白最先被吸脱下来，硫酸铵后被吸脱下来，从而达到分离的目的。3、需用的仪器和试剂
层析柱、试管、铁架台、恒压瓶
饱和硫酸铵、10%氢氧化钠、1%硫酸铜、1%氯化钡
4、实验步骤
凝胶的预处理、装柱、盐析、上样收集、鉴定、数据处理；5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。结合多媒体幻灯演示6、考核要求
以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告等平时成绩为主要考核内容7、实验报告要求
实验报告应包括下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；
（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；（7实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算或用文字说明
（8）分析与讨论，要对实验结果作出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。
实验二醋酸纤维薄膜电泳法分离动物血清蛋白质
1、本次实验的目的和要求
掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理，操作及测定动物蛋白质的相对百分含量技术2、实验内容或原理
蛋白质是两性电解质，在pH值大于其等电点的溶液中成为带负电的阴离子，在电场中移向阳极。血清中的数种蛋白质在同一pH条件下由于其解离状况不同、，带点不同，在电场中移动速度不同，采用电泳法可将其分离。醋酸纤维素是纤维素羟基乙酰化形成的纤维素乙酰酯将它溶于有机溶剂后，涂抹成均匀的薄膜待溶剂干后即称为醋酸纤维薄膜。3、需用的仪器和试剂
水平电泳装置、培养皿、试管、电泳仪、电泳槽、
0.07mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液、氨基黑10B、漂洗液、透明液4、实验步骤
（1）醋酸纤维薄膜的润湿和选择
（2）制作电桥：将缓冲液倒入电泳槽中，根据电泳槽的纵向尺寸，于两极支架上各放入三层滤纸，滤纸的一端与支架的前端对齐，另一点进入缓冲液中，除去气泡使滤纸紧贴于支架上，即为纸滤桥。
（3）点样：无光泽面朝上，在距负端1.5cm处，盖玻片点样注意点样时应使血清均匀的分布在点样区形成有一定宽度粗细均匀的直线，这是获得重要清晰区带电泳图谱的重要环节之一。可事先在滤纸上练习点样。
（4）电泳：将点好样的薄膜无光泽面向下，两端贴在电泳槽支架的滤纸上，点样端在负极。平衡10min，调电压最大，然后调电流，0.6mA/条，预电泳10min，调电流1mA/条，电泳45min关闭电源.注意电泳过程中防止电压偏高或偏低.
（5）电泳完毕，取出薄膜直接浸入染色液(.氨基黑10B)中，染色五分钟（6）漂洗：漂洗液漂洗直至背景染色脱去呈白色，可看出清晰的五条区带.
（7）记录：由正极依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。记下迁移距离。
（8）透明：甲液2min，乙液1min，宁缺毋滥。取出薄膜贴于载玻片上放置于阴凉处晾干备用
5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求
同上7、实验报告要求
实验报告应包括下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；
（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；（7实验结果。明确提出本次实验的结论，用文字说明（8）分析与讨论，要对实验结果作出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。
实验三血清乳酸脱氢酶同工酶的分离与测定
（聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法）
1、本次实验的目的和要求
掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。学会用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶。
2、实验内容或原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺，在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。血清样品中含有5种同工酶，在同一pH条件下，解离状况不同，通过聚丙烯酰胺凝胶具有的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应将五种同工酶分离。3、需用的仪器和试剂
离心机、中压电泳仪，电泳槽、注射器、玻璃管、加样器、
丙烯酰胺贮液、过硫酸铵、蔗糖、核黄素、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT4、实验步骤
（1）贮液及制备（分离胶每份15ml，浓缩胶每份5ml，可供60人使用）
（2）制胶：用注射器在玻璃管管底加入3-4滴蔗糖→加样器加胶至管高2/3处→加1cm重蒸水水封→放到水浴锅的试管架上聚合→除去上层水封→加入1cm大孔胶→加1cm重蒸水水封置于灯管下→聚合至凝胶呈乳白色。
（3）安装：将卸掉皮筋、胶帽、乳胶管的玻璃管装入圆盘电泳槽中，排出管两端的气泡。（4）上样：样品组成为：兔血清+40%蔗糖+0.1%溴酚蓝（体积比1：1：1）。上样80μl。（5）电泳：上槽连接负极，下槽连接正极。开始时调节电流2mA/管，3min后调节电流4mA/管。电泳时间根据指示剂染料的迁移来决定，当溴酚蓝指示剂接近凝胶底部1cm时停止电泳。
（6）剥胶：用注射器吸满水，从浓缩胶的一端小心的插入到管壁与凝胶之间，转动玻璃管同时推动注射器，靠水流的压力和润滑作用将玻璃管与凝胶分开，最终使凝胶从玻璃管中脱落。
（7）．染色：避光37℃保温10-30min，凝胶条上可显示出紫色的LDH带。从正极依次为LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4）（其中LDH4和LDH5含量较少）
（8）．计算相对迁移率：
相对迁移率=点样点到各带的距离/点样点到染料的距离（9）．染色的固定：将凝胶条放入7%醋酸中脱色和固定。5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求
考核要求同上。7、实验报告要求
实验报告要求同上。
实验四动物肝脏DNA的提取
1、本次实验的目的和要求
了解DNA和RNA的不同溶解性质。学习用盐溶液法从动物组织中提取DNA的原理和操作技术2、实验内容或原理
核酸和蛋白质时构成生物有机体的主要成分，在生物体内核酸通常是与蛋白质结合成核带白的形式存在，核蛋白有脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白。在浓的NaCl溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度更大，核糖核蛋白溶解度很小，而在稀的NaCl溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度很小，而核糖核蛋白溶解度很大，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白从样品中分别提取出来.经提取到的核蛋白用SDS处理，会引起蛋白变性而与DNA分开，氯仿—异戊醇可将蛋白沉淀除去，DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量的冷乙醇，DNA即析出。.3、需用的仪器和试剂
试剂：0.1MNACL-0.05M柠檬酸钠混合液，5MNaCl，25%SDS，氯仿异戊醇，
95%冷乙醇。
仪器：小烧杯、玻璃棒、大滴管、量筒、离心杯套筒、匀浆器、小天平、称量纸。4、实验步骤
(1)细胞的破碎：取8g新鲜的动物内脏，用15ml0.1MNaCl-0.05M柠檬酸钠混合液放入匀浆器中研磨，然后倒出匀浆，4000rpm离心10min，弃去上清液。
(2)洗涤：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M柠檬酸钠混合液，玻璃棒搅拌，4000rpm离心，10min，倒掉上清液。
(3)蛋白质变性：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M柠檬酸钠混合液，混匀后加入8滴SDS60℃水浴保温10min，此步的目的是使DNA与蛋白质分离。(4)DNA溶解：稍冷加入5MNaCl溶液2ml，搅拌10min。
(5)蛋白质沉淀：加等体积的氯仿—异戊醇，震荡20min，4000rpm离心10min，离心杯中出现三层，上层为含DNA和残留的DNA核蛋白的水层，中层为变性蛋白质凝胶，下层是氯仿—异戊醇的有机相层。
(6)DNA析出：吸出上层的水相，慢慢加入95%冷乙醇，用玻璃棒搅出丝状的DNA，晾干即为DNA实验产品。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求
同上基本考核要求。7、实验报告要求
同上实验报告要求
实验五紫外吸收法测定核酸含量
1、本次实验的目的和要求
学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法2、实验内容或原理
DNA和RNA都具有紫外吸收的性质，它们的紫外吸收高峰在260nm处。其紫外吸收特性是由于它们含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统的特性所决定的。每毫升溶液含1μgDNA钠盐的光吸收值为0.020，因此在260nm处测的未知样的光吸收值即可求出其含量。
3、需用的仪器和试剂
试管、紫外分光光度计、水浴锅晾干的DNA粗制品，蒸馏水4、实验步骤
（1）用盖玻片刮取1mgDNA粗制品，溶于10倍体积的蒸馏水中。
(2)在260nm波长下，以蒸馏水作参照，在紫外分光光度计上测定其吸收值。5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求
考核要求同上。7、实验报告要求
实验报告要求同上。
实验六应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用
1、本次实验的目的和要求
转氨基作用是动植物界普遍存在的一种生化反应，研究动植物体的转氨基作用可以了解动植物体不同发育阶段代谢动态的一个侧面，从而研究控制其代谢途径。2、实验内容或原理
由转氨酶催化，经转氨基后，原来氨基酸上的氨基转移到酮酸的相应位置上，形成新的另外一个氨基酸和酮酸，可在滤纸上进行层析并被茚三酮溶液检出。3、需用的仪器和试剂
匀浆器、培养皿、试管、毛细血管、吹风机、
0.01mil/L磷酸缓冲液，丙氨酸，α-酮戊二酸，饱和苯酚4、实验步骤
（1）肌肉靡的制作：取新鲜鱼肉糜100g，加入100ml0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，用匀浆器制成匀浆备用。
（2）酶促反应：管号试剂0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/Lα-酮戊二酸(ml)肌肉靡(ml)1.01.02.01.01.02.0对照管测定管对照管加入肌肉靡后立即煮沸10min，而后放入37℃水浴中保温30min，测定管37℃保温30min后，立即于沸水浴中加热10min终止反应。冷却后将二管分别过滤2滴到载玻片上待用。
（3）．点样：取层析纸一张，找出圆心。通过圆心作垂直线，在2条垂直线上于圆心相
丙0．5cm测谷对照距0.5cm处，分别作为测定管和对照管及标准丙氨酸，谷氨酸的点样位置如图所示。点样时将毛细管口轻轻点在滤纸上，使斑点直径3mm，重复三次，每次待完全干燥后再点下一次。
（4）展层：点样前在层析纸的圆心处打一小洞，取一小层析纸条，剪成刷状，卷成灯芯状，插入小孔内，使毛刷朝下，点样面朝上平放在盛有饱和苯酚的培养皿中，上面盖上合适的培养皿。大约45min待溶剂前沿达到培养皿边缘小于1cm处，取出层析纸，记下溶剂前沿去掉纸芯用吹风机吹干层析纸。
（5）显色：用喷雾器向层析纸均匀喷洒0.1%茚三酮溶液，吹风机吹干，层析纸上可看到紫色的斑点，比较色斑的位置及色的深浅记录点样点到色斑的距离及到点样点到溶剂前沿的距离。
（6）计算每个样点的Rf值
Rf=点样点到色斑的距离/点样点到溶剂前沿的距离5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求
同上基本考核要求。7、实验报告要求
要求同上
六、实验教材及主要参考资料
刘祥云，张云贵，李天俊主编，《生物化学实验指导》，201*年李建武等主编，《生物化学实验原理和方法》，1994年赵永芳主编，《生物化学技术原理及应用》，201*年
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