细胞生物学实验报告
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细胞生物学实验报告
小鼠脾细胞原代培养
姓名：杜旭学号：201*00230155系年级：201*级临七一班同组者：赵伟日期：201*/4/25
【实验目的】
⒈学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。⒉了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。⒊学习细胞计数及营养液的配制。
【实验原理】
⒈细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
⒉细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。●死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：
☆死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
☆死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。
【实验用品】
⒈材料小白鼠⒉试剂
台盼蓝、伊红、PBS缓冲液、细胞培养液（含生长因子）⒊器材
剪子、棉球、75%酒精、移液枪、无菌操作台、正置光学显微镜、倒置光学显微镜、解剖盘、滴管、离
第1页细胞生物学实验报告
心管、离心机、注射器、Eppendorf管、培养皿、酒精灯、塑料培养皿、载玻片、盖玻片、血细胞计数板
【实验步骤】
⒈取材
取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。
⒉分离脾细胞
用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用“L”型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用“L”型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。
吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min离心5min。⒊培养脾细胞
取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。
⒋配制染液
用生理盐水配成5%台盼蓝染液，备用。⒌染色
取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况，注意不要有
气泡产生，放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。
⒍计数
在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。
⒎计算细胞活力
根据公式：细胞活力=(总细胞数-死细胞数)/总细胞数×100%
【实验结果】
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台盼蓝染色后的细胞（10x10）伊红染色后的细胞（10x10）
总细胞数和活细胞数统计表（10×10）
项目自己培养细胞老师培养细胞总细胞数个/ml活细胞数个/ml细胞活力1.4×1067.5×1053.0×1055.5×10521.4%73.3%【分析与讨论】
⒈结果分析
本次实验中我们小组自己培养细胞所测细胞活力为21.4%，并不算高，分析得应有以下原因可能影响实验结果（包括误差）：
⑴若在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会极大的影响观察，导致实验失败。
⑵若在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡。
⑶染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这是导致细胞活力比较低的重要原因。
⑷实验中的一些操作不正确或不规范的情况、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。⒉注意事项
⑴严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。
⑵严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。⑶吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞。⑷离心管入台前，管口、管壁应消毒。
⑸实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
⑹器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
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扩展阅读：细胞生物学实验报告
实验六细胞膜的渗透性
一、实验目的
了解细胞膜[1]的渗透性及各类物质进入细胞的速度[2]
二、实验原理
1、在等渗溶液中，细胞对各种溶质的透过性不同。有的溶质可以进
入，有的溶质不能渗入。
2、渗入的溶质能提高细胞的渗透压，促进水分子进入细胞，引起溶
血现象[3]。
3、不同的溶质渗入到细胞内的速度不同，因此溶血时间也不同。
三、实验材料
新鲜血液（鸡血、猪血、牛血等）
四、实验器材
试管（1.5cmX18cm）、试管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml烧杯（2个）、250ml容量瓶、移液枪、胶头滴管、菜刀、吸球、电子天平、显微镜、盖玻片、载玻片、秒表
五、实验药品及试剂0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸铵、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝剂[4]
六、实验步骤1、制备血液稀释液
（1）抗凝剂的制备：首先称取1克肝素钠粉末，然后加入0.17M
NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均匀，制成肝素抗凝剂。
（2）血液稀释液的制备：取新鲜血液，按比例（肝素抗凝剂:血液
=1∶10）混合均匀，配制成经肝素抗凝的血液[5][6]。
（3）按比例（经肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混
合均匀，形成一种不透明的红色液体[7]。
2、低渗溶液（空白对照）的观察
取试管一只，加入10ml蒸馏水，然后再加入1ml稀释的血液。注意观察溶液颜色的变化。结果是溶液由不透明的红色变为澄清。记录下这个过程所要的时间。3、红血球的渗透性
按表一的配制，分别在下列十种等渗溶液中进行实验。轻轻摇动，注意有无颜色变化，是否有溶血现象发生，记下时间（自加入稀释血液到溶液逐渐由红色变为透明澄清，红血球全部溶血所需时间），填入表一的空格中。4、显微观察
[1]何为细胞膜？[5]注意：这一步，动作要非常迅速，否则鸡血会凝固。或者先把抗凝剂加入到烧杯中，再加入新鲜的[2]鸡血，边加边震荡即可。为何不同物质进入细胞的速度不同？[6]为什么新鲜的鸡血会凝固？[3]何为溶血现象？[7]为什么这一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝剂？（1）血液红细胞的观察
滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片。用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色。
（2）细胞破碎的观察
在上一步的载玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。
七、实验结果与分析
1、比较和分析你所观察到的实验结果，并解释原因。
结果：
（1）在所提供的试剂中不溶血的有：
（2）在所提供的试剂中不完全溶血的有：（3）在所提供的试剂中完全溶血的有：结果分析与比较：结论：
2、绘制你所观察到的血液细胞图。
3、讨论溶血实验在研究中应用的可能性。附1：试剂配制表
1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸铵需要＿＿＿＿＿＿克草酸铵，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克无水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。
附2：表一在不同低渗溶液下溶血现象的调查
编号12345678910试剂10ml0.17MNaCl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNaNO3+1ml稀释的鸡血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀释的鸡血10ml0.12M草酸铵+1ml稀释的鸡血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀释的鸡血10ml0.32M甘油+1ml稀释的鸡血10ml0.32M乙醇+1ml稀释的鸡血10ml0.32M丙酮+1ml稀释的鸡血是否溶血时间
附3：溶血结果的判断
（1）不溶血：液体分2层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好。（2）不完全溶血：溶液混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞破裂。（3）完全溶血：液体变红而且透明，镜检发现细胞全成碎片。
附4：细胞膜内外物质交换示意图
原始生命向细胞进化所获得的重要形态特征之一，是生命物质外面出现了一层膜性结构，即细胞膜。细胞膜和细胞内膜系统总称为生物膜(biomembrane)。
细胞膜(cellmembrane)，又称原生质膜，是细胞结构中分隔细胞内、外不同介质和组成成分的界面。其厚度通常为7～8nm，由脂类和蛋白质组成。一般蛋白质占60%-80%，类脂占20%-40%，碳水化合物约占5%。关于细胞膜的结构模型，流体镶嵌模型是目前被最广泛接受和认可的观点。该模型由美国加州大学的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。该模型突出了膜的流动性和不对称性，其结构特征是：生物膜的骨架是磷脂双分子层，其中磷脂分子的疏水性尾部相对，极性头部朝向水相。蛋白质或嵌在脂双层表面，或嵌在其内部，或横跨整个脂双层，表现出分布的不对称性。根据在膜上的位置不同，膜蛋白可分为两类：通过强疏水或亲水作用同膜脂牢固结合不易分开的，称为整合蛋白(integralprotein)或内在蛋白；附着在膜表层，与膜结合比较疏松容易分离的，称为外周蛋白(peripheralprotein)。细胞膜的表面还有糖类分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂双层具有流动性，故蛋白质分子也可以在脂双层中横向移动；又因膜的内外表面上脂类和蛋白质的分布不均匀，反映了膜两侧的功能不同。
细胞膜是细胞与周围环境和细胞与细胞间进行物质交换和信息传递的重要通道。其最重要的特性是半透性，或称选择透过性，对进出入细胞的物质有很强的选择透过性。这是细胞膜最基本的一种功能，如果丧失了这种功能，细胞就会死亡。细胞膜的功能有：
1)分隔形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大
增加，提高了发生在膜上的生物功能；
2)屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过；3)选择性物质运输，伴随着能量的传递；
4)生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等；5)物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的转运功能实现的，其主要转运方式有四种，即单纯扩散、易化扩散、主动转运、入胞和出胞作用。6)细胞膜的受体功能：受体是细胞识别和结合化学信息的特殊结构，其本质是蛋白质。实验八细胞融合实验目的
掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。实验用品
1.材料鸡红细胞
2.器材和仪器普通光学显微镜、普通低速离心机、恒温水浴箱、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片
3.试剂50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理盐水实验内容
一、原理
细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇
(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。二、方法
1.取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。2.称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的37℃Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中备用。
3.取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，沿离心管壁滴加50％PEG溶液，边加边晃动试管使之混匀，37℃水浴20min。
4.取出离心管，缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，800g离心3min，弃上清。5.用贴壁的液体重悬细胞，取一滴制成滴片，加盖片镜检。结果：在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。三、融合率的计算
在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：
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