兽医微生物实习总结
动物科技学院
本、专科生毕业实习总结
姓名：学院：专业：班级：学号：
201*年5月31日
学生姓名指导教师学号专业班级实习地点预防兽医微生物实验室一、实习目的、任务1.熟悉实验室内微生物鉴定的基本流程。2.熟练实验室内细菌的鉴定的操作3.了解沙门氏菌形态与染色特性以及主要培养特性；4.熟悉沙门氏菌常规微生物学诊断法；5.掌握沙门氏菌生化试验的方法和原理；6．熟悉沙门氏菌在选择性和鉴别培养基上的生长表现；二、实习内容未知细菌的分离鉴定和培养，生化特性，以及微生物实验室常用的实验操作三、实习效果与收获通过这次实习，使我意识到了自身存在的一些不足，比如动手能力太差，对书本上的知识理解不够深入，最重要的是通过这次实习，我收获了很多。这次实习，我主要做的是对一个细菌的简单的鉴定。沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有201*多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。1实验材料1.1菌种：待检的病鸭体内分离的沙门氏菌1.2培养基：半固体培养基、普通平板、麦康凯平板、三糖铁高层斜面、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水1.3生化管：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、枸橼酸盐、硫化氢、尿素1.4生化试剂：吲哚试剂、M-R试剂、V-P试剂2实验内容2.1配培养基营养琼脂培养基：称取33.0g营养琼脂于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节PH7.3±0.1，121℃高压灭菌15min，冷却后制成平板。麦康凯琼脂培养基：称取55.0g麦康凯琼脂于1000mL蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，调节PH7.2±0.2，121℃高压灭菌20min，冷却后无菌条件下制成平板。三糖铁琼脂：称取三糖铁琼脂63.4g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后制成高层斜面。枸橼酸盐培养基（购自北京陆桥技术有限责任公司）；葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）；胰蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水麦康凯培养基，呈红褐色，用于肠道菌的分离与鉴定；能分解乳糖的细菌--菌落红色；不能分解乳糖的细菌菌落灰白色。三糖铁琼脂，制成三糖铁高层斜面，呈红褐色，用于测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的发酵作用及能否产生硫化氢；能发酵乳糖、蔗糖，培养基呈黄色；发酵葡萄糖不发酵乳糖、蔗糖，底层呈黄色、斜面部分为红色(少量酸接触空气而氧化细菌生长利用含氮物质,生成碱性化合物)；能产生硫化氢，培养基呈黑色；能产气的细菌，底层琼脂内有气泡。葡萄糖蛋白胨水，黄色液体培养基，用于增菌培养，做MR,VP试验。蛋白胨水，无色液体培养基，用于增菌培养，做吲哚试验。2.2细菌的分离培养无菌条件下将待检菌，取单菌落分别接种于普通培养基，麦康凯，恒温培养24-48小时后观察菌落的生长情况观察每种平板上细菌的生长情况，比较单个菌落的形态：染色镜检。2.3观察结果观察麦康凯、普通平板上细菌生长情况。该分离菌在普通琼脂平板上可形成灰白、圆形、光滑、湿润、微隆起、边缘光滑、直径1~2mm的菌落;在麦康凯培养基上长成半透明、圆形、湿润、直径约0.5~1mm的菌落。该分离菌为革兰氏阴性小杆菌。分离培养实验操作过程中由于实验不小心出现了写差错，麦康凯平板上长有两种菌落，粉红色与灰白色中间带一黑点的菌落。粉红色的是大肠杆菌，能分解乳糖，第一次划线处有菌苔生成，第二次划线处有较多单个菌落出现，直径约2mm，为扁形光滑突起粉红色菌落，第三次划线处基本没有菌落出现；白色中间带一黑点的菌落为沙门氏菌，不能分解乳糖，第一次划线处看不到，第二次划线处有沙门氏菌菌落，但是仅观察到3个菌落，为扁形光滑突起灰白色菌落，直径约1.5mm，第三次划线处基本无细菌。分析此培养基结果，成功分离得到沙门氏菌的菌落，达到实验目的，但是划线技术不够成熟，划线后细菌在培养基上生长的线条不优美，非常凌乱。普通平板上也成功分离得到沙门氏菌的菌落，达到实验目的，但是依旧划线技术不够成熟，划线结果不甚理想。挑取麦康凯培养基上的沙门氏菌的菌落，做镜检，革兰氏染色，结果显示大部分为紫色，少部分为红色，染色结果不甚理想，但是可以观察到是杆菌。革兰染色脱色时间不够，没有染好，技术不够成熟。2.4做生化试验2.4.1五糖发酵试验在无菌条件下，用接种针将分离纯化的疑似大肠杆菌单菌落接种于五糖微量反应管，并封口标号，置于37℃恒温培养22-24h后观察结果。变黄色者为阳性，不变色者为阴性。4.2三糖铁试验阴性。2.4.2三糖铁试验用接种针将疑似大肠杆菌单菌落划线接种于三糖铁斜面上并进行穿刺，于37℃恒温培养22-24h后观察斜面底层颜色变化及产气情况。若斜面和底层变黑则有H2S产生。若斜面和底层均变成黄色为产酸，若为红色为产碱。2.4.3IMVC试验吲哚试验：将疑似大肠杆菌的菌落分别接种于蛋白胨水培养基，在培养24h后的蛋白胨水培养基内加3-4滴二甲苯，摇动数次，静置1-3min，待二甲苯上升后，沿试管壁徐徐加入两滴吲哚试剂，观察其颜色变化。在二甲苯和培养物之间出现玫瑰红色者为阳性反应，不变色者为阴性。甲基红试验：将疑似大肠杆菌的菌落分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，在培养24h后的葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂5滴，培养基呈红色者为阳性，呈黄色者为阴性。VP试验：将疑似大肠杆菌的菌落分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，培养24h后，将葡萄糖蛋白胨水培养物内加入3-5滴6％α萘酚溶液（甲液），然后加入等量的16％KOH（乙液），用力振荡，数分钟内出现红色者为阳性，不变色者为阴性。柠檬酸盐利用试验：用接种针将疑似大肠杆菌单菌落划线接种于柠檬酸盐斜面上并进行穿刺，培养24h后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长并观察其颜色变化。若变为蓝色则为阳性，若仍呈绿色为阴性。2.5生化结果判定2.5.1．靛基质试验（吲哚试验）取出试管（蛋白胨水）→乙醚1ml，振荡，静置，待分层后→沿管壁加入对二甲基氨基苯甲醛3-5滴，在分界处出现红色玫瑰吲哚为阳性。2.5.2．葡萄糖蛋白胨水一分为二（1）甲基红（MR）试验：取出试管→加入甲基红3-5滴，摇匀，培养基变红色为阳性，不变色为阴性（2）VP试验：取出试管→VP甲液0.6ml，摇匀→再加VP乙液0.2ml，15min后看结果，变红为阳性，不变为阴性，橙色为结果不可信，需重做。靛基质试验(吲哚试验)原理：细菌若含有色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。培养基：蛋白胨水试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+培养基液面为黄色：－应用：用于肠道杆菌的鉴定甲基红试验原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。培养基：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红试剂(pH4.2红色-pH6.3黄色）结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：－应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌V-P试验原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。培养基：葡萄糖蛋白胨水结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色：－应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌。细菌生化反应结果记录表三糖铁糖发酵斜底硫氢沙门红黄+葡萄糖-乳糖麦芽糖+甘露醇-+--+-蔗糖面层化甲基红VP试验吲哚硫化氢脲枸酶橼酸盐+总之，通过这几个月的实习，我收获了很多的理论知识的同时，也收获了很多的实践经验，本次实习，我认真努力的完成老师的安排，虽然有些实验结果不是令人很满意，但我在刘文华老师的指点下分析自身的原因和其他的一些因素，找出自己的不足，和产生错误的原因。使我收获了很多实验技能，在实验过程中，我深刻的认识到了自己掌握知识的局限，在以后的生活中，我会在努力用理论武装自己的同时，把握机会提升自己的实践技能，争取取得更大的进步。最后特别感谢在这次实习中，一直指导我们的老师，同时诚挚的感谢师哥以及实验室的其他师哥师姐。因为他们我学到了很多的实验技能和专业知识，使自己取得了一定的进步实习总结成绩
扩展阅读：兽医微生物实习报告
一．实习目的
为了使学生能够理论联系实际，通过亲自实地解剖感染小鼠，对小鼠的心、肝、脾进行麦康凯琼脂平板划线培养，以柯赫法则为这次实习的主线，达到鉴定出小鼠感染的菌种的目的，熟练运用微生物实验课的所涉及的实验操作和方法，提高实验动手能力，分析实验过程中可能出现的问题，并解决问题。特开设微生物教学实习，掌握基本技能，加深理论部分的理解，能够独立诊断出传染病病菌，获得严谨的科学实验素养。
二．实习材料
实验动物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠
实验器械，主要包括：小鼠解剖工具手术剪、镊子、蜡盘、钉子，接种棒、酒精灯、打火机、记号笔、手套、载玻片、枪头、注射器、离心管。
实验材料：麦康凯琼脂平板、各种染色液（结晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黄水）、蒸馏水、培养基（普通肉汤培养基、蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、固体培养基）、PBS重悬液、生化试验材料（微量发酵管（葡、乳、枸、尿素、麦、甘醇、蔗、硫）、对二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基红、vp甲乙液）。
实验主要仪器：离心机，分光光度器，温箱，摇床，超净工作台
三．实习内容
以柯赫法则为主线，通过对感染小鼠的剖解采样、分离培养、镜检、扩增培养，然后把得到的纯培养物对健康小鼠进行再次接种以获得被感染小鼠，再次重复以上操作，把获得的纯培养物通过镜检观察和做生化实验来鉴定出感染小鼠的致病菌。
四．实习操作进程
第一天：实验设计、讨论症状、分离剖解
1实验设计：以小组为单位进行实验设计，明确此次实验主要法则是：柯赫法则。在老师的指导下确定此次实习的主要步骤，讨论实验中可能遇到的问题以及注意事项。
2讨论症状：比较观察健康小鼠与病鼠，可见到病鼠一般呈萎靡状，不活跃。每组领取一只感染小鼠观察症状，体表基本正常。
3分离剖解：先将麦康凯琼脂平板分三区，依次写上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，将小鼠摇晕，采用颈椎脱臼法将小鼠处死。将小鼠尸体仰卧固定于蜡盘上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔软部用剪刀剪一小口，然后从该小口处往上、往下剪将皮毛剥离，剥离腹膜暴露出肝脏和脾，可观察到有轻微的肝肿胀，颜色变淡。将肝和脾切开一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。再打开胸腔观察，可见胸腔有出血现象和凝血块，剪开心包膜，将心脏切一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。写上班级组别，日期，置于温箱中培养至第二天早上8点。
第二天：挑取单菌落，镜检，扩增培养，重悬，测OD配浓度，小鼠腹腔注射
1挑取单菌落：观察麦康凯琼脂平板上菌落的形态为圆形，边缘整齐，表面光滑，暗红色，圆心处颜色较边缘浅。挑去单个菌落，画上记号准备做后续试验。
2镜检：选取所挑选菌落的一半进行抹片。取干净玻片，滴半滴去离子水，用接种环挑取菌进行抹片、干燥固定、采用格兰染色法染色：草酸铵结晶紫染色1-2’，水洗，革兰氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脱色约30’’-1’，水洗，沙黄水溶液复染10’’-30’’，水洗。吸干，镜检。观察到该菌被染成红色，是格兰阴性菌。3扩增培养：选取剩余的菌接种到肉汤培养基中，置于温箱培养9个小时至菌的生长对数期。4重悬测OD值配浓度：下午5点左右，将培养的菌转入无菌小管中离心，离心后可见菌沉于管底，在超净工作台内操作，去上清液，用枪头吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反复吹打使其重悬，然后再次离心，去上清，重悬，通过分光光度计测得OD590的值，配成2*10^7CFU浓度的菌液。
5小鼠腹腔注射：每组挑选一只健康小鼠，在头部或尾部做上记号，用右手抓住鼠尾，将其摇晕
，令其前爪抓住铁丝盖上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠头颈部皮肤，并翻转左后使其腹部朝上，将其尾巴夹在左手掌与小指之间，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后侧面插入针头，先刺入皮下，后进入腹腔，注射时阻力，皮肤也无泡隆起。注射完将小鼠放回鼠笼即可。
第三天：观察小鼠发病情况
小组成员分时间段观察小鼠感染情况，见小鼠濒死的尽快解剖接种分离致病菌。若一整天未见小鼠有异常情况的等第二天解剖
第四天：剖解划线培养
虽然小鼠未见萎靡，由于预订的感染时间差不多，可以进行解剖接种第一天的操作，可见体表有淤血点，剖开的小鼠肝脏流出大量的血液。其余均同第一天的操作，将麦康凯琼脂平板的上所接的菌置于温箱中培养。
第五天：生化鉴定
观察到平板上只有一个较小的暗红色菌落，挑取该菌落进行扩增培养9小时至细菌生长的对数期。下午6点观察，培养液依旧是澄清的，很可能没有长菌。为做进一步的验证，进行生化试验。将该菌接入微量发酵管（）和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培养至第二天看结果。
第六天：观察结果，整理报告
生化试验无任何反应，说明接的菌为杂菌或污物，整理实验报告并分析失败原因。
六．实验结果与分析
此次试验失败
给小鼠攻毒，未能分离出致病菌，因此也无法鉴定出小鼠被感染的病原菌为何种肠杆菌科
试验失败原因可能有：
1、接种棒火焰消毒后，等待冷却的时间过短，接种棒接种菌时将菌烫死2、由于小鼠的免疫力强，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接种到治病菌3.给小鼠注射的量或浓度还不够未能达到使小鼠感染的目的
4、在第一次从小鼠体内分离出来的菌可能不是致病菌，或者麦康凯琼脂平板上培养出来的菌落不止一种，而我们挑选到的某一菌落恰好不是致病菌。
5、在进行腹腔注射时，可能没有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。6、采样时可能由于接种环未完全伸入到心、肝、脾的组织中，或者伸到的组织里恰好没有致病菌
7、可能由于小鼠感染的时间过短，还未达到菌生长曲线的高峰期
七．思考与总结
1此次试验失败的原因有很多在我看来最有可能的原因有以下几点：
（1）小鼠免疫:由于这些小鼠是实验室的小鼠，长期被用来做各种致病菌的实验，使得它们获得一定的免疫，所以虽然注射了足够使小鼠感染发病的剂量，但也被小鼠免疫掉了，而无法从小鼠体内获得病料。（2）病料不够：从学姐那了解到，她们做攻毒实验的动物，都是将整个组织块磨碎以后，
再接到培养基上，而我们做实验是只是用接种棒挑取一点，接种棒上粘到的病料比较少或根
本没有，因此培养不出菌。
（3）挑取的单菌落未必是致病菌：由于平板上长出可能不止一种菌，因此挑到的单菌落，未必是致病菌。
2为什么扩增出来的菌不直接注射小鼠，而要经过离心？因为菌可能会产生毒素，若直接注射可能就无法判断使小鼠发病的到底是毒素作用，还是因为病菌在小鼠体内繁殖感染而造成的。3肠杆菌科有哪些，特征有哪些？学生自我鉴定：
201*年5月16号到21号期间进行了维持一周的微生物实习，在微生物实习期间，我能够做到主动和小组成员交流、合作、解决问题，认真完成实验操作，学会灵活运用自己的专业知识解决问题。
通过这段时期的实习，我们对无菌操作有了进一步的理解，掌握了仪器操作的基本技能，巩固了理论部分的知识，也了解到公共卫生意识的重要性。实习不过短短的五天，在这短暂的五天内，，我们有过发现时的喜悦，有过解剖小鼠时的紧张，有过培养不出菌时的困惑，但最终我们收获了知识，也收获了友谊，在合作中共同进步，在困难中共同进退，一切的困难便能迎刃而解。
这次微生物实习为我们专业的继续拓展提供了宝贵的经验，为动物医学本科专业的我们学习后续课程奠定扎实的基础。
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