微生物实习报告
林业与生物技术学院
实习报告
学生姓名：娄钧翼学号：201*01220327专业名称：生物科学微生物班级：生物科学102班指导教师：张昕
201*-6-26
一、实习目的意义
1、通过实习过程掌握酸奶中乳酸细菌的分离纯化
2、土壤中自生固N菌分离、纯化、生长曲线测定：通过实习过程，掌握土壤中微生物的分离、纯化和生长曲线测定的技术；
3、参观临安青山污水处理厂：参观污水处理厂，了解其运行模式，以及在污水处理过程中微生物发挥的作用和技术；
4、参观富阳海正药业有限公司：了解一个大公司大企业的运行情况，以及专业方面的一些技术和应用。
二、实习地概况
1、第一个和第二个实验是在学校学六实验室完成的；
2、第三个实验：临安市青山污水处理有限公司成立于201*年3月21日，于201*年5月1日投入试运行，是一个集污水收集、处理于一体的公益事业企业。公司坐落于浙江省临安市青山湖街道研口村发达畈，占地66亩，近期投资8082万元，建成处理能力2万吨/日，收集管网42公里，工艺采用MSBR法，具有脱氨除磷功能的污水处理设施。公司坚持内抓管理强素质，外创先进塑形象，通过规范化、制度化、精细化、科学化的管理来不断提高污水处理水平，努力提升科学管理层次，切实增强企业核心竞争力。公司设备、工艺先进，技术力量雄厚，现有职工21人，其中技术人员15人。公司先后通过了ISO9000和ISO14000质量环境管理体系认证及清洁生产认证。同时被评为浙江省公众满意单位杭州市环境保护模范企业、临安市花园式工厂、临安市安全声场先进单位、临安市卫生先进单位、临安市绿色企业等荣誉称号。
3、第四个实验：占地16000平方米，累计投资超过2.6亿元，设有60多个单元实验室，集小试、中试与研发支持为一体。始创于1956年的浙江海正药业股份有限公司秉承“执著药物创新，成就健康梦想”的使命和“成为广受尊重的全球化制药企业”的愿景，致力于整合药物研发与生产资源，为全球客户提供更好的产品和服务，通过美国FDA、欧盟EDQM、澳大利亚TGA、韩国KFDA等官方认证的品种达到40多个，销往全球30多个国家和地区。
201*年，公司荣获“全国五一劳动奖状”，海正、HISUN及图形被认定为“中国驰名商标”，入选“中国万种微生物基因组计划”和“国家重大（磅）级药物品种产业化技术创新联盟”。因圆满完成“抗甲流药物中间体生产”的国家任务，受到省政府的通令嘉奖。
201*年，公司入选浙江省医药工业“十强企业”，并荣获“国内最佳产品线十佳工业企业”称号，同时被誉为“金蜜蜂奖成长型企业”。
我们主要参观了海正药业在富阳的分公司。
三、材料方法
1、材料：乳酸细菌培养基、酸奶
原理：当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会是PH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于PH
值降低，再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长。因此十分容易鉴别乳酸菌。
方法：1.1(6月7日)配备乳酸细菌培养基(蛋白胨10.0G,牛肉膏10.0G,酵母膏5.0G,
柠檬酸氢二铵2.0G,葡萄糖20.0G,吐温801.0ML,乙酸钠5.0G,磷酸氢二钾2.0G,硫酸镁0.58G,硫酸锰0.25G,琼脂18.0G,蒸馏水1000ML,PH6.26.6)
1.2(6月7日)培养基灭菌
1.3(6月8日)用灭菌后冷却至50摄示度左右的培养基到成平板
1.4(6月8日)用灭菌过的接种环挑取酸奶在平板上划线纯化培养4天左右1.5(6月12日)挑取平板上菌落制成临时装片观察
2、材料：阿须贝无氮培养基、土壤
方法：2.1(6月12日)配备阿须贝无氮培养基(葡萄糖10.0G,磷酸氢二钾0.2G,硫酸
镁0.2G,氯化钠0.2G,CaSO4’2H2O;0.1G,碳酸钙5G,琼脂18G,蒸馏水1000ML,PH7.2)阿须贝无氮培养液(葡萄糖10.0G,磷酸氢二钾0.2G,硫酸镁0.2G,氯化钠0.2G,CaSO4’2H2O;0.1G,碳酸钙5G,蒸馏水1000ML,PH7.2)
2.2(6月12日)培养基,培养液灭菌
2.3(6月12日)用灭菌后冷却至50摄示度左右的阿须贝无氮培养基到成平板2.4(6月12日)用灭菌过的镊子将黄豆大小的菜园土埋入已冷凝的平板培养基上2.5(6月12日)正面放置28度培养4天
2.6(6月18日)用灭菌过的接种环挑取菌苔在新的阿须贝平板上划线纯化32度
培养
2.7(6月20日)单菌落接入液体培养基中于12.24.36.48H后测吸光值.制备生长
曲线
四、结果分析
1.平板上有一个个单菌落.在显微镜下观察单菌落就只有一种乳酸菌.酸奶中有保加利亚乳
菌与嗜热链球菌二种.2.
五、实习感受
通过此次实习，我学到了很多课堂上学不到的东西：亲自动手配培养基，分离、纯化菌类，
学会使用分光光度计制作生长曲线，同时参观了一些与微生物紧密相连的公司，了解其运行模式、实践技术和应用。这让我清楚地感到了自己肩上的重任，看清了自己的人生方向，也让我认识到了科研工作应支持仔细认真的工作态度，要有一种平和的心态和不耻下问的精神，不管遇到什么事都要去思考，多听别人的建议，不要太过急燥，要对自己所做的事去负责，不要轻易地去承诺，承诺了就要努力去兑现。实习也培养了我的实际动手能力，增加了实际的操作经验，对实际的科研工作的有了一个新的开始，更好地为我们今后的工作积累经验。
我知道科研工作是一项需要热情的事业，并且要持之以恒的精神和吃苦耐劳的品质。我觉得重要的是在这段实习期间里，我第一次真正地接触了实验，在实践中了解了一些科研技术，并且在此期间，我参观了一些公司，也与社会有所接触。利用这次难得的机会，也打开了视野，增长了见识，为我们以后进一步走向社会打下坚实的基础。
实习期间，我从末出现无故缺勤。我认真听取老师的指导，对于别人提出的实验建议虚心听取，并能够仔细观察、切身体验、独立思考、综合分析，并努力把学到的知道应用到实际实验操作中去，尽力做到理论和实际相结合的最佳状态，培养了我的耐心和素质。
为期两个多星期的实习结束了，我在两个多星期的实习中学到了很多在课堂上根本就学不到的知识，受益匪浅。回想自己在这期间的实习情况，也有不足之处。对此我思考过，学习经验自然是一个因素，然而更重要的是心态的转变没有做到位，有些实验步骤还是停留在应付的层面上。现在发现了这个不足之处，应该还算是及时吧，因为我明白了何谓工作何谓实际。在接下来的日子里，我会朝这个方向努力，在实验操作方面我会更加谨慎。
本次实习是我第一次亲身感受了所学知识与实际的应用，理论与实际的相结合，让我们大开眼界，也算是对以前所学知识的一个初审吧!这次实习对于我们以后学习、找工作也真是受益匪浅。我会把这此实习作为我人生的起点，在以后的工作学习中不断要求自己，完善自己，让自己做的更好。
扩展阅读：微生物实习报告
一.了解实验设备工作及使用方法
洁净工作台
室内空气经预过滤器和高效除尘后以垂直或水平层流状态通过工作台的操作区，操作台保持无菌状态。工作前后，要用紫外线照射15min。使用时，关掉紫外灯，打开工作灯；用酒精棉球擦手，一切操作都要在酒精灯火焰周围。高压蒸汽灭菌锅
立式高压蒸汽灭菌锅。一般在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20min。培养箱
恒温培养箱摇床
氧气的传递较好，培养好养性微生物。
二．菌种分离
（一）实验目的
1．掌握培养基的配方及配置方法。
2．掌握稀释涂布平板法和分离纯化微生物的基本操作技术。（二）基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基使一种广泛和最普通的细菌基础培养基。牛肉膏提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，NaCl提供无机盐，琼脂作为凝固剂。
牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏10g蛋白胨20gNaCl10g琼脂36g水201*mlpH7.0~7.2
高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基数由可溶性淀粉（作为碳源）、KNO3、NaCl、K2PO44H2O、MgSO47H2O（作为微量元素，提供钠、磷、镁、硫等离子）和FeSO47H2O（作为微量元素，提供铁离子）等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。
高氏1号培养基可溶性淀粉KNO320gNaCl1gK2PO44H2O0.5gMgSO47H2O0.5gFeSO47H2O0.5g琼脂20g水1000mlpH7.4~7.6（三）材料
1．溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl，可溶性淀粉，KNO3，K2PO44H2O，MgSO47H2O，FeSO47H2O
2．仪器或其它用具：8个盛9ml水的试管，2个盛90ml水的三角瓶，1涂棒，接种环，7个培养皿，8个移液管，一人一个试管。（四）步骤1．配制牛肉膏蛋白胨培养基（依次加入，琼脂最后加，配好后测pH，用缓冲液调节pH），然后分装20个三角瓶。将配好的高氏1号培养基加入试管中。
2．把培养基和试管，以及所有的用具都灭菌。在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20min。（水中细菌总数的测定时用的器材也一起灭菌）。把加入培养基的试管摆好斜面。
3．稀释涂布平板法
（1）制备菌液在洁净工作台上进行。在酒精灯旁边，吸取10ml菌液注入盛90ml水的三角瓶中，摇匀。
（2）倒平板在洁净工作台上进行。方法是右手持盛培养基的三角瓶，置火焰旁边，左手拿平培养皿（小指和无名指托住皿底，中指和大拇指卡住皿盖边缘，食指放在皿盖上）。然后左手将培养皿在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基至能铺满皿底，轻轻摇动培养基是培养基均匀分布，至于桌面上。再将三角瓶口的培养基在酒制备稀释液在酒精灯火焰上烧干。
（3）涂布在洁净工作台上进行。等培养基凝固之后，在7个培养皿上分别标出10-1,10-2，10-3，10-4,10-5,10-6,10-7。首先吸取1ml的菌液加入有99ml的三角瓶中摇15min，然后用先灭菌好的装有9ml无菌水的试管稀释（用一支移液管先吸取1ml的稀释菌液加入9ml无菌水的试管中，摇匀，再将稀释过的菌液取0.5ml加入培养皿，然后用无菌涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（依次类推其他梯度）。
（4）培养将涂布好的培养基放置37℃恒温培养箱中倒置培养24小时。（5）转移保藏（6月5号）（五）结果分析（6月5号）（六）讨论
注意事项：一定要倒置培养，以防培养过程中出现的水滴入培养皿，把培养皿中的菌体相互污染。
三．水中细菌总数的测定
（一）目的
1．学习水中细菌总数测定方法。2．学习稀释混合平板法（倾注平板法）。（二）原理
倾注平板法测定水中的菌总数，以一定培养基平板上生长出来的菌落计算出来的菌总数仅是一种近似值。采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。（三）材料
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，5个培养皿，6支装有9ml水的试管，5支移液管
（四）步骤
1．灭菌（与上一个实验一起灭菌）。
2．与稀释涂布平板法大部分相同，不同的是，做5个梯度，10-1,10-2，10-3
，10-4,10-5，并且先吸取每个梯度的菌液加入培养皿中，然后加入冷却至45℃
的培养基，摇匀，使样品中的微生物和培养基充分混合均匀，待冷却凝成平板后，分别在37℃恒温培养箱中倒置培养24小时。（五）结果分析
在5个梯度的平板中，只有101的平板上长出一个菌落，则1ml水中约有10个细菌。（六）讨论
1．只有101的平板上长出一个菌落，以此计数相当的不准确，应当加做实验再测定水中细菌总数。可以以原菌液以及2-1，4-1，8-1，16-1为梯度再用稀释平板法测定计数。
2．应当取湖泊水或者是河流水，细菌较多。自来水已经经过消毒灭菌。
四．酵母菌生长曲线的测定
（一）目的
1．学会制备液体培养基。
2．熟悉并掌握以血球计数板进行微生物技术的基本方法。3．学会绘制微生物生长曲线。（二）原理YPD培养基是适用于实验培养酵母菌的液体培养基。酵母膏帮助新酵母菌延滞期的生长，蛋白胨为微生物提供氮源，葡萄糖为酵母菌复制繁殖提供营养和能量。YPD培养基酵母膏1%蛋白胨2%葡萄糖2%pH5.8~6.2（三）材料
酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，三角瓶（每人一个），5ml移液管，血球计数板，酵母菌悬液（四）步骤
1．制备培养基，分装三角瓶中，每瓶100ml.，用带有滤纸的封口膜扎口，外加两层报纸。
2．灭菌将三角瓶和移液管在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20min。3．接菌在洁净工作台上进行。在酒精灯火焰旁，移取5ml酵母菌悬液加入冷却后的液体培养基中。扎口时，去掉两层报纸，然后，放摇床上37℃恒温培养。
4．计数从接上酵母菌开始，第一次测酵母菌个数，此后每过4小时测一次，用血球计数板测，一个三角瓶测一次数据。如果菌液中个数过多，就用9ml的无菌水稀释，再测。（五）结果分析（6月6号）时间h01.917个数×10832时间个数1.35×101043.7×108361.79×101089.1×108401.42×1010123.488×109441.76×1010161.2×109481.32×1010201.63×1010521.8×1010241.32×1010561.92×1010282.62×1010601.1×10lgN1110.5109.598.5801020酵母菌生长曲线3040506070时间（h）
（六）讨论
血球计数板清洗要干净，加入血球计数板中的菌液不可加过多，计数时要速度快。
五．菌种形态学鉴定及转移保存
（一）目的
1．学习描述菌落特征方法。
2．学习把细菌转移保存（从培养皿转移至试管）。3．学习并掌握革兰氏颜色和芽孢染色方法。（二）原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上有单菌体形成的群体形态。每一种微生物在一定的培养条件下形成的菌落个具有某些相对的特征，利用观察这些特征来区分各大类微生物。
革兰氏染色原理革兰氏染色是细菌分离和鉴定的重要性质。染色反应呈蓝紫色的成为革兰氏阳性，红色成为革兰氏阴性。主要区别在于细胞壁，革兰氏阳性菌的细胞壁是由肽聚糖形成网状结构，通透性比较低，在染成紫色后，不容易用酒精脱色，则成蓝紫色。阴性菌相反则成红色。芽孢染色原理利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同燃料进行染色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而便于区分。芽孢壁厚，通透性低，着色脱色均较困难。孔雀石绿在加热条件下可以进入菌体和芽孢，菌体中的染料经水洗脱色，芽孢不易脱色，再用番红复染，则菌体和芽孢区别开来。（三）材料
培养有细菌的培养皿，装有培养皿的试管，显微镜，载玻片，试管，水浴锅，孔雀石绿，番红，酒精，碘液，结晶紫（四）步骤
1．菌落形态观察（1）大小：大、中、小。（2）形态：圆形、不规则形。（3）干湿：干燥、湿润、粘稠。（4）高度：扁平、隆起、凹下。（5）透明度：透明、不透明。
（6）颜色：白色、乳白色、黄色、金黄色、绿色、红色、褐色等。（7）边缘：整齐、不整齐。2．革兰氏染色
①初染加结晶紫一滴，约1~2min，水洗。②媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③脱色将玻璃板上的水甩干净，衬以白背景，用95%酒精滴洗至刚刚不出现蓝色为止，立即用水冲洗。
④复染用番红染约1~2min，水洗。
⑤镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阳性呈紫色，阴性呈红色，以散开的细菌革兰氏染色为准，过于密集，常常呈现假阳性。
3．芽孢染色①滴几滴蒸馏水于试管中，用接种环刮取菌落在水中搅拌，之后加入几滴孔雀石绿，置沸水浴10min。
②然后用接种环蘸取菌液在载玻片上涂抹，等干燥，过火两下固定，水洗至孔雀石绿不再褪色为止。
③用番红复染1min。
④待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
4．转移保存在洁净工作台上进行，在酒精灯火焰旁边，将找到的菌种挑取一部分，在试管中从底部Z字型画线，之后烧一下试管口，棉塞过火，然后塞住试管。放置37℃恒温箱中培养。之后放入冰箱中保藏。（五）结果分析
菌落形态：中；圆形；湿润；扁平；不透明；白色；边缘不整齐。显微镜观察：芽孢染色观察不清楚
革兰氏染色呈紫色，革兰氏阳性。呈链球菌状
（六）讨论
用酒精清洗时不能时间过长，会出现假阴性结果。但清洗不干净，会出现假阳性结果。六．抗性菌株诱变
（一）目的
1．观察诱变随微生物的杀菌和诱变双重生物学效应。2．学会用紫外线对微生物诱变。（二）原理
紫外线辐射能引起DNA链的断裂、DNA内分子交联，从而导致细胞死亡或基因突变，其中形成嘧啶二聚体是导致基因突变的主要原因。由于存在光复活作用，鼓诱变处理及处理后的培养均应避免可见光照射（诱变处理应在红光下操作）。通常用照射时间或细胞致死率表示相对计量。（三）材料
磁力搅拌器，涂布棒，培养皿，移液管，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（四）步骤
1．器材灭菌涂布棒，培养皿，移液管，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20min。
2．菌悬液制备在洁净工作台上进行，在酒精灯旁边，把长有蜡样芽胞杆菌菌落的试管移近酒精灯，打开瓶塞，把准备好的生理盐水打开，倒入试管中至淹没大半试管中培养基的斜面，然后把装生理盐水的瓶放在酒精灯旁，把接种环灼烧后，贴壁移入试管中，在培养基平面Z字型画线，将菌种刮下，尽量不要刮下培养基，然后将试管中水倒入原来生理盐水的瓶中，再将生理盐水倒入试管，之后倒回生理盐水瓶中。摇匀。菌悬液制成。
3．倒平板在洁净工作台上进行，在酒精灯火焰旁，把牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加入培养皿，并斜置，是培养基在在培养基中成斜面，冷却后，将20ml青霉素液体加入200ml的培养基的三角瓶中，摇匀，在将此培养基加入培养基中，使与原来冷却的培养基同样高，置于桌面上冷却。
4．诱变处理取约15ml菌悬液于无菌培养皿中（内置磁棒），打开紫外灯，将培养皿放在磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，取下培养皿盖，开始计时，分别用5个培养皿做2min,4min,6min,8min,10min,处理。之后分别将5个处理的菌液接种在不同的培养皿中，做好标签。用黑纸包好，放置在34℃的恒温培养箱中培养24h。
5．观察菌落（五）结果分析
在诱变时间为2min,4min,6min分别有细小菌落出现。8min,10min没有菌落出现，导致菌体死亡。（六）讨论
可进行细小菌落进行在培养，以便观察其诱变是否产生形态学变化。
七．抗生素的效价测定
（一）目的
学习并掌握牛津杯和滤纸法（管碟二剂量）测定抗生素的效价。（二）原理
琼脂平板扩散法来测青霉素的效价。将规格一定的不锈钢小管（牛津杯）或滤纸置于带菌琼脂平板上，管中加入抗生素，在室温条件下扩散半个小时后放入恒温箱中培养，在菌体生长的同时，被抗生素扩散到琼脂夹板内，一直或杀死周围菌体，从而产生不长菌的透明抑菌圈。在一定的范围内，抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径呈直线关系。因此，根据抑菌圈直径的大小，可以求出相对应的抗菌物质的效价。（三）材料
蜡样芽孢杆菌菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基，青霉素（高剂量、低剂量）。不锈钢小管，滤纸，培养皿，镊子，直尺，滴管，试管等（四）步骤
1．在洁净工作台上进行，在酒精灯火焰旁，先在培养皿中加入一层牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，使覆盖底部。冷却后，再将准备的含有菌体加入培养基，再将含菌培养基加入培养皿。每组做五个平板。菌液培养基的高度尽量相同。2．将培养皿底部划线分四部分，牛津杯放在四部分中间，分别加入SH,TH,SL,TL（顺时针）溶液至满而不溢出。或者是，经滴有SH,TH,SL,TL溶液的滤纸顺时针放置于培养基的四部分中间。放置半小时后，放入恒温培养箱中
（五）结果分析
123平均值(1)求出W和V：
(2)W=（SH+TH）-（SL+TL）=0.87(3)V=（TH+TL）-（SH+SL）=0.63式中：TH：供试品高剂量之抑菌圈直径TL：供试品低剂量之抑菌圈直径SH：标准品高剂量之抑菌圈直径SL：标准品低剂量之抑菌圈直径
THd(cm)3.53.03.13.2SHd(cm)2.72.92.82.8SLd(cm)2.62.62.72.63TLd(cm)2.42.62.52.求出θ：（2）θ=Dantilog（IV/W）=1×artilog(0.63×lg2/0.87)=－1.51556
θ：供试品和标准品的效价比
D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。求出Pr：(5)Pr=Ar×θ=－120.925Pr：供试品实际单位数Ar：供试品标示量或估计单位（六）讨论
这个实验的培养基制备时要快，制作均匀，会减小误差。
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