发酵课程总结

发酵课程总结

课程总结

鲁彬彬100201*044

一、课程简介

《发酵工程》是一门由化学、生物学和工程学相互融合的交叉学科。不仅涉及生物技术的前沿领域，而且是其他生物技术产业化得重要技术基础，更是当今生物技术第三次浪潮工业生物技术的核心内容。发酵工程是包括上游的微生物菌种选育与培养技术、生化过程工程技术、下游的发酵产物的提取精制技术在内的综合性技术。随着现代生物技术日新月异、突飞猛进的发展，尤其是组学、系统生物学的发展，作为生物技术的重要组成部分的发酵工程也增加了更多的丰富内涵，也更加广泛地应用在包括轻工、食品、化工、医药、农业、能源、环保等在内的国民经济众多领域中持续地造福人类。与传统化学工程相比，发酵工程有一下突出特点：1、主要以可在生资源为主料

2、反应条件温和，多为常温、常压、能耗低、选择性好、效

率高的生产过程3、环境污染较小4、投资较小

5、能生产目前化学法不能生产的或用化学法生产教困难的性

能优异的产品。二、学习心得

学习了发酵工程这门课程，才发现自己正真的进入了自己的生物专业，才知道自己的专业原来学问这么高深。通过对发酵课程的学习，充分了解了发酵工程学的特点，研究领域，工艺条件控制和一些重要的发酵工程原理。例如：发酵动力学及一系列知识。同时也学习了发酵设备的知识。对实际工厂发酵流程有了充分的了解，这对以后进入工厂进行实际操作打下基础。其中，对通风发酵设备、厌气发酵设备和固态发酵设备进行了详细的学习。这使我们对发酵工艺流程有了非常的具体的掌握。最后、简单总结一下学习这门课程总结的一些注意点：1、发酵工程学是一门理论结合实际的课程，所以在学习书本

知识的同时要注意实际操作。

2、在学习发酵设备时一定要注意整体流程，仪器注意事项要

牢记，以免出现安全隐患。

扩展阅读：发酵总结

第一章绪论

1、发酵：通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需产品的生物反应过程。

2、发酵工程：是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程体系，是生物工程技术学科的重要组成部分。包括菌种的选育和保藏、菌种的扩大生产、微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化、微生物生理功能的工业化应用。

3、工业发酵的类型：按对氧的需求：需氧发酵，厌氧发酵，兼性厌氧发酵。按培养基的物理性状：液体发酵，固体发酵。

按发酵工艺流程：分批发酵，连续发酵，补料分批发酵。

4、通常将现代生物技术划分为基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。

5、路易斯巴斯德（LouisPasteur），法国微生物学家、化学家，开辟了微生物领域，近代微生物学的奠基人。巴斯德证明了三个科学问题：

（1）每一种发酵作用都是由于一种微菌的发展。“巴氏杀菌法”便应用在各种食物和饮料上。

（2）每一传染病都是一种微菌在生物体内的发展。

（3）传染病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，使他们从病菌变成防病的药苗。

巴氏灭菌法又称低温灭菌法，先将要求灭菌的物质加热到65℃30分钟或72℃15分钟，随后迅速冷却到10℃以下。既不破坏营养成分，又能杀死细菌的营养体，巴斯德发明的这种方法解决了酒质变酸的问题，拯救了法国酿酒业。

7、发酵工业的三个转折点：纯培养技术的建立，深层液体通气搅拌纯种培养，代谢控制发酵工程技术的建立。6、发酵工业的特点

发酵工业：利用微生物具有的加工和生物转化能力，将廉价的发酵原料转化为高附加值产物的产业。

①发酵过程一般都是在常温常压下进行的生物生化反应，反应条件比较温和。②可以选择廉价的原料生产较高价值的产品。

③发酵过程是通过生物体的自适应调节来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较专一的代谢产物。

④由于生物体本身具有的反应机制，能专一性地和高度选择性地对某些较复杂的化合物进行特定部位的生物转化修饰，也可产生比较复杂的高分子化合物。⑤发酵生产不受地理、气候、季节等自然条件的限制。7、发酵工业的范围及例子。①微生物菌体：酵母（面包）、单细胞蛋白（SCP）。②酶制剂：淀粉酶（葡萄糖）、果胶酶（澄清果汁、精炼植物纤维）、蛋白酶（皮革加工、饲料添加剂。③代谢产物：

初级代谢产物：对数生长期产生的代谢产物，是细胞生长和繁殖所必需的物质。具有重要的应用价值，供商业开发。

◇初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物，如：氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂，菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累。

次级代谢产物：微生物进入缓慢生长期或者停止生长时期即稳定期所产生的物质。药物筛选和开发的重要资源。

◇次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成，如：抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感

④生物转化：利用微生物细胞或酶对某些化合物的特定部位进行催化修饰，使之转化为结构相似具有更大经济价值的化合物。

范畴：脱氢，氧化，羟化，缩合，还原，脱羧，氨化以及异构作用等。优点：效率高、专一性强、条件温和。

8、发酵工艺流程：菌种制备、培养基的制备、灭菌、接种、控制发酵条件、产物的提取与精制、回收处理三废物质。

①用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配置；②培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；

③扩大培养有活性的适量纯种，以一定比例将菌种接入发酵罐中；

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④控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；⑤将产物提取并精致，以得到合格的产品；⑥回收和处理发酵过程中产生的三废物质。9、发酵工程在国民经济中的应用①医药工业：

⊙抗生素：1201*余种

青霉素、金霉素、四环素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、螺旋霉素、头孢霉素等

⊙氨基酸：可发酵生产的有谷、赖、丙、组、异亮、亮、苯丙、脯、苏、色、酪、缬、瓜、鸟氨酸（国内40亿元，占发酵业产值12%）⊙维生素：VB2、VB12、Vc、VA、VD等

生物制品：亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗等⊙酶抑制剂：

棒酸（可抑制-内酰胺酶对青霉素的破坏）淀粉酶的抑制剂可治疗糖尿病胆固醇抑制剂可治疗高血压高血脂

②食品工业：酵母、有机酸谷氨酸、调味料、红茶和乌龙茶、酒类、酒精、发酵乳制品；

③能源工业：生物乙醇、沼气、微生物采油、生物电池；④化学工业：

醇及溶剂：乙醇、甘油、异丙醇、丙酮、丁醇、丁二醇等

有机酸：醋酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、水杨酸等多糖：黄原胶、海藻糖等⑤冶金工业：

⊙概念：将微生物及其代谢产物作为浸矿剂，喷在矿石上，从浸取液中得到有用金属

⊙应用：金、银、铜、锰、钴等⑥农业：

⊙生物肥料（固氮菌、钾细菌、磷细菌）、生物农药（苏云金杆菌或其变种所产生的伴孢晶体能杀死蛾类幼虫的毒蛋白等）、兽类抗生素（泰乐霉

素、抗金黄色葡萄球菌素）、食品和饲料添加剂、农用酶制剂、动物生长调节素、单

细胞蛋白饲料；

⑦环境保护：工业三废、生活垃圾、农业废弃物等变废为宝净化环境

无色杆菌具有清除氰、腈剧毒化合物的功能；产碱杆菌、无色杆菌、短芽孢杆菌对联苯类致癌物质具有降解能力。

第二章发酵工业菌种

1、发酵工业的微生物可以分为两类：可培养微生物和未培养微生物。

2、发酵工业应用的可培养微生物可分为四类：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌。细菌：单细胞的原核生物，自然界分布最广，数量最多，与人类关系最密切。二

分裂方式繁殖。最常用的：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌。放线菌：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。

存在：有机质丰富的微碱性土壤，大多腐生，少数寄生。作用：生产各种维生素。以无性孢子进行繁殖，菌丝片段进行繁殖。酵母菌：

形态结构：单细胞真核生物，无鞭毛，有一定形态大小，随菌龄和环境条件的变化而异，一般为圆形、椭圆形、卵圆形、柠檬形等，有的可形成假菌丝。繁殖方式：无性繁殖：芽殖、裂殖；有性繁殖：子囊孢子。

菌种特征：与细菌相似，比之大而厚。菌落表面光滑，湿润，粘稠，大部分为乳白色，少数呈现红色或黄色。

分布：含糖较多的酸性环境，水果、蔬菜、花蜜和植物叶子以及果园土壤中。霉菌：

形态结构：由分枝或不分枝的菌丝构成，菌丝交织形成菌丝体。细胞结构有明显的分化。菌落呈大小和颜色等特征，不同菌种差别很大，蜘蛛网状，棉絮状和丝绒状。繁殖方式：繁殖能力很强，产生有性和无性孢子进行繁殖，菌丝片段亦可繁殖。3、发酵工业所需菌种：

细菌类如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、棒杆菌、梭状芽孢杆菌等；

酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、汉逊酵母和假丝酵母等；霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等；

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放线菌如各种抗生素，链霉素、庆大霉素等。

4、未培养微生物：采用现有的微生物纯培养分离和培养方法还没有获得纯培养的微生物。

极端微生物：在极端环境下能够生长的微生物。

未培养微生物的研究方法：模拟自然培养法和宏基因组分析法。

模拟微生物生长的自然环境进行可培养研究。集中在原位培养，培养条件优化和单细胞操作等方面。依据基因或基因组、蛋白质序列及其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。5、发酵工业菌种的分离筛选：

概念：将混杂有各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取快速，准确有效的方法进行分离和筛选，从而得到所需微生物的过程。

方法设计依据：生产的实际需要、目的代谢产物的性质、产生目的产物的微生物种类、微生物的分布、特性和生活环境。

获得目的菌种的两个重要环节：菌种分离和菌种筛选。筛选必须注意：采用方法的选择性和灵敏度。6、发酵工业对菌种的要求：

①在廉价原料制成培养基上生长，目的产物产量高，易回收；②生长速度快，发酵期短；③培养条件易控制；

④抗噬菌体和杂菌污染能力强；

⑤稳定的遗传学特性：菌种质量稳定，不易变异退化；⑥对放大设备的适应性强；

⑦菌种不是病原菌，无有害的生物活性物质和毒素产生；7、符合要求的菌种获取途径:①从菌种保存机构直接购买；②从自然界分离筛选；

③发酵水平的批号中重新分离筛选。

8、从自然界中获取就菌种的步骤：样品采集→样品的预处理→目的菌富集培养→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定→菌种保藏。※样品的采集原则：来源越广泛，得到新菌种可能性越大；目标产物的性质和产生目标产物的微生物性质以及生理特性。

※土壤特点：土壤的有机质含量和通风状况；土壤酸碱度和植被状况；地理条件；季节条件。

※样品的预处理方法：物理法（热处理、膜过滤法、离心法）、化学法（几丁质放线菌、CaCO3稳定PH嗜碱性放线菌）、诱饵法。

※富集培养：使混合微生物群体中某特定微生物比例激增的培养方法。目的：增加待分离微生物的数量，提高分离效率；

原理：不同种类微生物生长繁殖对环境和营养的要求不同，创造合适条件，使目的微生物迅速生长繁殖，成优势菌种；

方法：控制培养基的营养成分、控制培养条件；分类：分批培养、连续培养、半连续培养。※菌种分离：

目的：把目的微生物从混合的多种微生物中分离出来；

方法：平板划线分离法、稀释分离法、简单平板分离法、涂布分离法、毛细管分离法、小滴分离法。※菌种初筛与复筛：

目的：选择产物合成能力较高的菌株；

菌种的鉴定：产物可和指示剂、显色剂或底物等发生反应直接定性鉴定；生产性能测定初筛和复筛。

初筛：把具有目的产物合成能力的微生物从分离后的大量微生物中筛选出来。方法：平板筛选；摇瓶发酵筛选。

复筛：在初筛基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛选；方法：摇瓶培养。野生型菌株：直接从自然界的样品中分离得到的具有一定生产性能的菌株。※发酵工业菌种鉴定：

内容：测定必要的鉴定指标、查权威鉴定手册，确定菌种类型。

技术水平：细胞的形态和习性水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因或核酸水平。

指标：形态、生理、生化以及遗传等指标。

鉴定方法：经典分类鉴定方法；现代分类鉴定方法；权威鉴定机构鉴定。

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经典分类鉴定方法指标：形态学特征、生理生化特征、血清学实验与噬菌体分型、氨基酸序列与蛋白质分析。

现代分类鉴定方法：微生物遗传型的鉴定（DNA的碱基组成、核酸的分子杂交、遗传重组特性分析、rRNA序列分析）、细胞化学成分特征分类法、数值分类法。※发酵工业菌种改良：

目的：改变微生物的遗传结构，打破原来的代谢调节机制；根据需要，

进行目的产物的过量生产。

目标：提高目标产物的产量、提高目标产物的纯度，减少副产物、改良

菌种性状，改善发酵过程、改良产物合成途径，以获得高产的新产品。

育种方法：常规育种、细胞工程育种、基于代谢调节的育种技术、蛋白

质工程育种、基因工程育种、代谢工程育种、组合生物合成育种、反向生物工程育种

育种：利用物理或化学诱变剂处理微生物群体，促使突变率显著提高。育种优点：提高代谢产物的产量，改进产品品质、扩大品种和简化生

产工艺；简单易行、工作进度快、收效显著

基因工程育种原理：人为的方法将供体遗传物质的DNA分子提取出来，

离体条件下切割，获得目的基因，把此基因与合适的载体连接起来。导入受体的细胞内，目的基因在受体细胞内进行复制和表达，得到目的产物。

蛋白质工程育种技术：

、定向进化技术：在不知道蛋白质的空间结构或根据现有的蛋白质结构知识不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段体外模拟自然进化的过程，使基因发生大量变异并从中定向选出所需性质和功能的蛋白质的过程。

、定点突变技术：以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新蛋白质的氨基酸序列，运用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。

※发酵工业菌种保藏：菌种退化：生产菌种或筛选出来的优良菌种，在接种传代或保藏后，某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象；原因：基因突变、连续传代。

退化的防止：控制传代次数：避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度。

经常纯化、创造良好的培养条件、利用单细胞移植传代、采用有效的菌种保藏方法。菌种的复壮：在菌种的生产性能未衰退前，有意识的进行纯种的分离和性能的测定，以期菌种的性能逐步提高。

复壮方法：纯种分离、在宿主体内生长进行复壮、淘汰衰退的个体。

菌种保藏原理：根据微生物的生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物的带谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。保藏的方法：

1、斜面低温保藏法4C；3-6个月原理：低温；

2、砂土管保藏法产孢子或芽孢微生物，1年原理：低温、干燥、隔氧和无营养物

3、菌丝速冻法甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20C4、石蜡油封存法1年左右

5、冷冻真空干燥保藏法任何微生物；一般5年以上原理：低温、干燥、缺氧。6、液氮超低温保藏法-196C；保护剂；保存期长保藏菌种的质量控制：

1、保藏样品制备前，应反复核对，检测生理生化指标，与亲本特征比较。2、保藏样品制备后，仍要按3%抽样检查，一旦有误，此批全部废掉。3、注重菌种保藏的连续性。冷冻保藏：代谢作用停止。

1、细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。2、速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；

3、大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。

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4、用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。

第三章发酵工业培养基设计

培养基：用于维持微生物生长繁殖和产物形成的营养物质。

培养基的共性：最大量的目的产物、合成速率最大、副产物最少、培养基稳定，价格便宜、不影响搅拌性能和产物分离。

设计培养基的步骤：对发酵培养的成分和原材料的特性具有详细的了解、结合微生物和发酵产品的代谢特点进行合理选择和优化。一、发酵工业培养基的要求

1、工业培养基：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按照一定比例配制而成的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制、产品的产量和质量都有重大影响。2、制备工业培养基的原则：

①提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；②提高单位营养物质的转化率；

③有利于提高产物的浓度，以提高单位发酵罐的生产能力；④提高产物的合成速度，缩短发酵周期；

⑤减少副产物的生成，便于产物的分离纯化，减少三废物质；⑥原料价格低廉，质量稳定，取材容易；

⑦尽可能的减少对发酵过程中通气搅拌的影响，提高氧的利用率，降低能耗。二、发酵工业的培养基成分及来源

从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。

薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。

粮谷类：高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。野生植物：橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。农产品加工副产物：米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。

培养基中必须有足够的碳源、氮源、水和无机盐，部分微生物还需要加入生长辅助类物质，才能正常生长。1、碳源：

功能：提供能源，合成碳骨架，合成目的产物的原料。

种类：糖类、油脂、有机酸、烃和醇类。碳源不足时，蛋白质水解物和氨基酸亦可。①糖类：葡萄糖、淀粉、蔗糖

葡萄糖：最易利用，几乎所有微生物都能利用；糖蜜：制糖的结晶母液，它是制糖工业的副产物；

淀粉糊精：多糖，也是常用的碳源；需经胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。②油和脂肪：

具有活跃的脂肪酶的微生物可利用该物质作为碳源，需要更多的溶解氧。

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种类：豆油、菜子油、葵花油、棉子油等。

③有机酸：发酵体系的PH值因利用有机酸作为碳源而升高，不同的碳源影响代谢的同时，也对发酵过程中PH值的调节和控制有着影响。

④烃和醇类：石油工业的发展，微生物工业的碳源范围扩大，能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样多。2、氮源：

功能：成菌体细胞物质；合成含氮代谢物；种类：有机氮源和无机氮源。

①有机氮源：蛋白胨、牛肉膏、豆粕、鱼粉等。②有机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水。

有机氮源不仅提供菌体生长繁殖的营养，有的还是产物的前体，无机氮源，有机氮源容易吸收，会PH的变化，防止PH过高的措施：加强搅拌；少量多次加入。

3、无机盐与微量元素：

无机盐：微生物生理活性物质的组成成分或生理活性物质的调节物；在较低的浓度下对微生物的生长和产物合成有促进作用。大量元素：生长所需浓度在10-3-10-4mol/l范围内的元素。加入化学试剂；微量元素：生长所需浓度在10-6-10-8mol/l范围内的元素。不必加入。4、生长调节物质：

有助于调节产物形成的物质；

分类：生长因子；前体；产物抑制剂；促进剂。

①生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物质；注意：不是所有的微生物都需要生长因子；来源：有机氮源是生长因子的重要；来源：种类玉米浆是多数发酵产品良好的氮源。

②前体：加入到发酵培养基，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但是产物的产量却因前体的加入而有较大提高的一类化合物。

大多数前体对微生物的生长有毒性，少量多次加入。

③抑制剂：加入后会抑制某些代谢途径的进行，使另一途径活跃，从而获得人们所需要的某种代谢产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累。应用：最初应用于甘油发酵，抗生素工业应用最多。如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以使酒精发酵受到抑制，而转入甘油发酵。

④产物合成促进剂：既不是营养物，又不是前体，是提高产量的添加剂，如酶生产中的诱导物或表面活性剂等。诱导剂能增加细胞的产酶速度，提高产酶量，但不能从根本上改变细胞原有的蛋白质模板。表面活性剂（洗涤剂，吐温等）：增加酶产量，机理不清楚。例如

◇巴比妥可增加链霉素产生菌的抗自溶能力，推迟自溶时间，增加链霉素积累。◇谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，加入红霉素可提高产量25%以上。5、水：

比热大，吸收代谢过程中产生的热量，避免细胞的温度骤然升高；热的良导体，有利于调节菌体温度。微生物机体的重要组成成分；直接参与代谢；代谢的内部介质，为微生物的生长繁殖和目的产物的合成提供必需的生理环境。三、微生物的培养基类型：

根据成分：天然培养基，半合成培养基，合成培养基；根据物理状态：固体培养基，半固体培养基，液体培养基；根据生产流程和作用：斜面培养基，种子培养基，发酵培养基。斜面培养基：生长繁殖和保藏菌种。富含有机氮源；种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基；

发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。

选择培养基：培养基中加入某些化学药品，抑制不需要的微生物生长，促进需要微生物的生长。一般指含有抑菌剂或杀菌剂的培养基，加入的物质没有营养作用；加富培养基：按照某种微生物营养要求，配制适合这种微生物生长而不适合其他微生物生长的培养基，达到分离这种微生物的目的。培养出来的是营养要求相同的一类微生物；

鉴别培养基：根据微生物能否利用培养基中的某些成分，依靠指示剂的颜色变化来鉴别不同种类微生物的培养基。四、培养基的设计原理和优化方法：

完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大的一个重要步骤。在发酵过程的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或

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积累代谢产物，对最终产品的得率具有非常大的影响。1、的基本原则：培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。目的明确；营养协调；理化条件适宜；经济节约。

以粗代精，以野代家；以废代好，以简代繁；以烃代粮，以纤代糖；以氮代朊，以国代进。

2、考虑因素：菌体的同化能力，对菌体代谢的阻遏和诱导作用，碳氮比对菌体代谢调节的重要性，PH值对不同菌体代谢的影响。

体的同化能力：一般只有小分子能够通过细胞膜进入细胞内进行代谢；微生物能够利用复杂的大分子是由于分泌各种水解酶，在体外将大分子水解为微生物能直接利用的小分子；微生物来源和种类不同，所分泌的水解酶系不同；有的微生物由于水解酶系的缺乏，只能利用简单物质；在碳源和氮源的选取时特别要注意，许多碳源和氮源都是复杂的有机大分子，如淀粉、黄豆饼粉等；用这类原料，微生物须具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶。培养不能分泌淀粉酶的菌株，可先将淀粉糖化，有些微生物，如大多数氨基酸产生菌，缺乏蛋白水解酶，可先将有机氮源水解。

代谢的阻遏和诱导：根据微生物的特性和培养目的，注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的配合，发挥各自优势，避其所短。菌体利用葡萄糖时产生的分解代谢物可能阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性（葡萄糖效应）；在抗生素发酵时，种子培养基所含的快速利用碳源和氮源往往比发酵培养基多；有时需考虑分批补料或连续补料。酶制剂的生产，也应考虑碳源的分解代谢阻遏的影响，对于许多诱导酶来说，易被利用的碳源（如葡萄糖或果糖）不利于产酶。有些产物会受氮源的诱导与阻遏，如通常蛋白酶的生产受培养基中蛋白质或多肽的诱导，而受铵盐、硝酸盐、氨基酸的阻遏，应考虑氮源以有机氮源（如蛋白质）为主。

合适的碳氮比：碳氮比对生长繁殖以及产物合成的影响极其显著；源过多，会使菌体生长过旺，pH偏高，不利代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量；碳源过多则易形成较低的pH；碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。碳氮比也随碳源及氮源的种类以及通气搅拌等

条件而异。不同生长阶段，对碳氮比的最适要求可能不同。一般来讲，因为碳源既作为碳架参与菌体和产物的合成，又作为生命过程中的能源，故比例要求比氮源高。一般工业发酵培养基的碳氮比为100:(0.2-2.0）;但在谷氨酸发酵中因产物含氮量较高，所以氮源比例相对高些，一般取100:(15-20）。如碳氮比为100:(0.5-2.0），则只长菌体而不合成谷氨酸。

pH的要求：pH是微生物生长和代谢的极为重要的环境因子；微生物在利用营养物质后，由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成，会造成培养体系中pH的波动；发酵过程中调节pH的方式一般不主张直接用酸碱来调节；要保证发酵过程中pH能满足工艺的要求，合理配制培养基是决定因素，因而在配制培养基选取营养成分时，除了考虑营养需求外，也要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲能力的影响。

3、发酵培养基的优化步骤：根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题，初步确定培养基的组成；通过单因子优化实验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度；最后通过多因子实验，进一步优化培养基的各种成分及其浓度。

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第四章发酵工业的无菌技术

灭菌的意义：在培养过程中污染杂菌，便会在较短时间内大量繁殖，与生产菌争夺营养成分或分泌代谢产物抑制生产菌的生长和代谢，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒灌，严重影响生产。

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发酵工业中允许的染菌概率是10，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。

灭菌的范围：培养基、气系统、加料、酵罐、道系统。一、发酵工业的无菌技术灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。

消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器皿表面的微生物。除菌（degerming）：用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐（antisepsis）：用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。二、发酵工业污染的防治策略

1、污染的危害

①由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；②杂菌合成一些新的代谢产物，或杂菌污染后改变了发酵液的某些理化性质，使发酵产物的提取和分离变得困难，造成产物收率降低或产品质量下降；③杂菌代谢会改变原反应体系的PH，使发酵发生异常变化；④杂菌降解产物，使发酵失败；

⑤细菌发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，导致整个发酵失败。2、不同情况下污染情况分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响

细菌发酵：发酵周期短，防止噬菌体污染；

霉菌发酵：发酵周期长，产物类型不同，染菌情况复杂；酵母菌发酵：防止细菌和野生酵母菌污染；疫苗发酵：采用基因工程菌。

（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响；

种子扩大时期：种子受到污染后，灭菌弃去；

发酵前期：迅速重新灭菌，再接种，从头开始发酵；

发酵中期：危害极大。影响生产菌生长和产物的积累。早发现、快处理；发酵后期：可继续进行发酵或提前放罐。

（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响增加产物的提取难度、影响产品质量。3、杂菌污染的防治

（1）污染的检查与类型的判断

①显微镜检查法；②平板划线培养检查法；③肉汤培养检查法；④发酵过程中异常现象观察法。

◎显微镜检查法：染色→低倍镜（生产菌）→高倍镜（杂菌的存在）；此方法需要一定时间，对于发酵周期短的生产菌，要结合其他方法。

◎平板划线培养检查法：待检样品在无菌板上划线，27°C或37°C培养，8小时后观察有无杂菌污染；

◎肉汤培养检查法：待检样品接入无菌的肉汤培养基中，分别于27°C和37°C培养，随时观察微生物生长情况，取样镜检是否有杂菌污染；

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◎发酵过程中异常现象观察法：溶解氧水平异常变化、PH值的变化、尾气中CO2的异常变化、发酵液黏度、泡沫的增多、发酵液颜色的变化4、污染的原因分析

种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善等。

（1）从污染杂菌的种类进行分析：如果是耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底造成的。如果是球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌，可能是种子带菌、空气灭菌不彻底、设备渗漏或操作问题。污染的是浅绿色菌落的杂菌，可能是冷却盘管渗漏。污染的是霉菌，无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题。污染的是酵母菌，主要是糖基灭菌不彻底，特别是糖液放置时间较长引起的。

（2）从发酵时间进行分析：前期染菌，种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当、无菌空气带菌。后期染菌：中间补料、设备泄露、操作问题。（3）从污染的程度分析：多数发酵罐染同一种菌，一般是空气系统有问题，如，空气系统结构不合理、空气过滤器介质失效；个别发酵罐染菌，一般是某个设备存在问题。5、杂菌污染的途径及防治（1）种子带菌及防治①培养基及器具彻底灭菌②避免菌种移接过程中污染

③避免菌种在培养或保藏过程中受到污染

（2）过滤空气带菌及防治①正确选择采气口②结合气候，设计空气预处理流程，设计和安装合理的空气过滤器；尽量减少过滤空气的含油量和湿度；提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度；保持过滤介质的干燥状态；防止空气冷却器渗漏。

（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及防治①发酵罐的死角加强清洗、定期除垢

②管道安装不当、配置不合理形成“死角”、安装符合要求。

（4）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治①原料性状的影响；②灭菌时温度和压力不对应造成染菌；③泡沫造成染菌；④灭菌时间不够或压力波动

大而染菌；⑤灭菌后期罐压骤变造成染菌。

（5）操作不当造成染菌①罐内压力骤跌；②泡沫顶盖；③管道阀门操作不当。（6）噬菌体染菌及防治①在细菌或放线菌发酵中，噬菌体的感染力很强。②噬菌体容易在空气中传播，环境污染是根源所在，净化环境。三、发酵工业的无菌技术

1、干热灭菌法：160°C-170°C,保温1-2h.保持干燥的实验器具和材料2、湿热灭菌法：121°C，30分

3、射线灭菌法：抑制DNA复制；臭氧4、化学药剂灭菌法5、过滤除菌法6、火焰除菌法

湿热灭菌的原理：由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时回放出大量热能，使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变化，造成微生物死亡。

四、发酵培养基及设备管道灭菌

1、湿热灭菌的原理：每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态；超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。●杀死微生物的极限温度称为致死温度。

●在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。

●微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件下的致死时间。

●相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。

D值：利用一定温度进行加热,90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。

Z值：在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%所需升高的温度，即为Z值。

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2.303lgtkN0Nt；N0开始灭菌时原有的活菌数，个；Nt经过t时间灭菌后

例：含有某种细菌的悬液，含菌数为105/ml,在100℃（212°F）的水浴温度中，活菌数降低到104/ml时所需的时间为10min,则该菌的D值即为10min。

D100=10min

如果加热的温度为121℃，则常写成Dr

2、湿热灭菌的优点：蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。3、微生物的热死规律对数残留定律

的残留菌数，个。

4、培养基灭菌高温短时的原因：随着温度的上升，微生物比死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。温度升高时，微生物死亡速率大于培养基的破坏速率。

5、影响培养基灭菌的其他因素（1）培养基成分对灭菌的影响

油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。

（2）培养基的物理状态对灭菌的影响（3）培养基中微生物数量对灭菌的影响

（4）微生物细胞中水分对灭菌的影响细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低（5）微生物细胞菌龄对灭菌的影响老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高（6）空气排除情况对灭菌的影响

（7）培养基中氢离子浓度对灭菌的影响培养基中氢离子浓度直接影响灭菌效果。◆微生物在pH6.0～8.0范围内耐热性最大

◆pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。（8）泡沫对灭菌的影响

◆泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；◆易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。

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6、分批灭菌：配制好的培养基放入发酵罐和其他装置中，通入蒸汽将培养基和设备一起灭菌的过程。也称实罐灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。7、分批灭菌操作（实罐灭菌）

（1）在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。

（若已先行空罐灭菌，此步可不进行）

（2）预热：向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音。（有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。）（3）开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。（升温过程）

（4）罐压达1kg/cm2(0.1MPa)时，安装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。（升温过程）（5）保温调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，

维持一定时间。

在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的

其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。（保温过程）

（6）保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐压力降至0.5kg/cm2左

右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。（降温过程）

通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压。（7）灭菌时间的计算

保温阶段时间的计算方法：

V=V加热+V维持+V冷却

R：气体常数；=1.986[卡/克分子K]

E：耐热孢子致死的活化能；=65000[卡/克分子]T：灭菌维持温度；121℃（393K）

T0：开始计算灭菌效果的温度；100℃（373K）

例：1）小型发酵罐在120℃灭菌维持15分钟，由100℃（100℃以下灭菌效果不计）加热至120℃的时间为5分钟，由120℃冷却到100℃的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。V加热1.986×3932(65000-2×1.986×393)51.152(393-373)×65000V冷却1.986×3932(65000-2×1.986×393)30.692(393-373)×65000V=V加热+V维持+V冷却

=1.15+15+0.69=16.6(min)

例２：如果灭菌条件不变，大罐由１００℃加热到１２０℃需２４分钟；冷却至１００℃的时间为１６分钟；求大罐的维持时间。

V加热V冷却1.986×3932(65000-21.986×393)(2416)9.2min2(393-373)×650002.303N0tlgkNP；

V加热RT2(E2RT)t加热(T-T0)E2；

V冷却RT2(E2RT)t冷却2(T-T0)E大罐维持时间V维持=V－（V加热＋V冷却）＝16.69.2=7.4min（8）分批灭菌的特点

优点：设备投资较少；染菌的危险性较小；人工操作较方便；对培养基中固体物质含量较多时更适宜。

缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置；

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冷却水用量大。

8、连续灭菌：配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却的过程。

连续灭菌流程：配料罐（兼作预热）→输料泵→连消塔（器）→维持罐（管）→冷却器→发酵罐（1）预热

可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作；温度：一般预热至70℃左右；预热的物料用泵泵入连消装置；输料泵：常用旋涡泵、往复泵、螺杆泵。（2）加热

物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130～140℃；常用连消装置有三类：套管式连消器、汽液混合式连消器、喷射式加热器。（3）保温

保温设备（维持设备）温材料包裹；两种形式：罐式；管式。（4）冷却

类型：喷淋冷却器、板式冷却器、真空冷却器。（5）连续灭菌的优缺点及注意事项

优点：1）可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；2）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。3）适于自动控制，降低劳动强度。缺点：设备复杂，投资大。连消注意事项：

1）连消前，应先进行空罐、维持罐（管）、冷却系统的灭菌；2）确保管路无渗漏；

3）当培养基含有较大固体颗粒或有较多泡沫时，采用连消容易发生灭菌不彻底。

9、发酵培养基和设备管道灭菌技术

空罐灭菌和管道灭菌；空气总过滤器和分过滤器灭菌；种子培养基实罐灭菌；发酵培养基实罐灭菌；发酵培养基连续灭菌:130°C/5min；补料实罐灭菌。

五、空气除菌实际生产中所需的除菌程度根据发酵工艺要求而定：既要避免染茵，又要尽量简化除菌流程，以减少设备投资和正常运转的动力消耗。

无菌空气：发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。1、除菌方法：辐射灭菌、加热杀菌、静电除菌、过滤除菌等。

2、介质过滤：采用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。

常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。

空气过滤除菌原理：采用定期灭菌的介质阻截流过的空气中所含的微生物制得无菌压缩空气。

3、提高过滤除菌效率的措施1）减少进口空气的含菌量2）设计安装合理的空气过滤器

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3）针对不同地区设计合理的空气预处理流程

4）降低进入的空气的相对湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作5）稳定压缩空气的压力

第五章发酵工业的种子制备

一、种子制备原理与技术

种子培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

种子培养的任务：为每次发酵罐的投料提供纯而壮的、活力旺盛的、接种数量足够的菌种。1、种子的条件：

①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；②生理性状稳定；

③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂菌污染，保证纯种发酵；

⑤菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。2、种子制备过程：

①把砂土管、冷冻干燥管中的菌种接入斜面培养基活化培养；

②把生长良好的斜面孢子或菌丝接种到摇瓶液体培养基中或扁瓶固体培养基中扩大培养；

③扩大培养的菌丝体或孢子接种到一级种子罐，制备生产用种子；④制备好的种子转种到发酵罐发酵。

3、种子的制备包括两个阶段：实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。①实验室种子制备阶段：把保藏在砂土管或冷冻管中的菌种，经过无菌操作接入合适的培养基将菌种活化。

一般采用两种方式

◆对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。

◆对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。

②生产车间种子制备：实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养。种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。

种子罐级数的确定：种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积

细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。如谷氨酸生产为二级发酵;

茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵

孢子悬浮液→一级种子罐（27C,40小时孢子发芽产生菌丝）→二级种子罐（27C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵。链霉素生产为四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌、放线菌快，通常用一级种子

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4、种龄与接种量

种龄：指种子罐中培养的菌丝体开始转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

接种量：指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。①接种量过大或者过小，均会影响发酵。

过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；

过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

②影响种子质量的因素：原材料质量；培养条件；斜面冷藏时间；培养基；PH值；种龄。

总的原则:种子培养通常都是倾向于快速细胞生成,而不是为了产物生成。5、种子质量的控制措施：种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查；适宜的生长环境；种子无杂菌检查。6、种子制备的放大原理与技术：细菌发酵时的种子扩大培养

目的：获得大量活力强的种子，尽可能缩短延迟期，在对数生长期接种。

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第六章发酵动力学

发酵动力学：是对微生物生长和产物形成过程的定量描述，研究各种过程之间的动态变量关系，确定发酵动力学参数特征以及各种发酵条件对这些参数的影响，并建立相应的数学模型，实现认识发酵规律、优化工艺、提高产量和效率的目的。

究内容包括了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生产速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速率的条件。一、分批发酵动力学

分批发酵是向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，培养过程中除控制温度、氧、泡沫和pH外不进行其他任何控制，反应结束后将全部培养液排出进行处理。

优点：操作简单；操作引起染菌的概率低；不会产生菌种老化和变异等问题。

缺点：非生产时间较长、设备利用率低。（一）微生物生长动力学

1、微生物的生长是指细胞体积的增大和细胞数目的增多。

2、分批发酵过程中，微生物的生长要经历延滞期、对数期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。

3、延滞期：分裂迟缓当细胞接种到新的环境(如从固体培养接种至液体培养基)后，需要适应新的环境。

延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关。

采取缩短延迟期的措施.。

在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。

4、对数期：细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加。

微生物的生长特性用细胞浓度和细胞数量倍增时间来表示。

处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，如果用作菌种，往往延迟期很短以至检查不出，这样可在短时间内得到大量微生物，以缩短发酵周期。

5、稳定期：生长速度逐渐趋向零。

对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。

稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。

稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数，可用下式表示：γ=菌体总生长量/消耗营养物质总量。

式中γ值的大小可说明该种细菌同化效率的高低。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

6、衰亡期：发酵罐内营养物质耗尽，对生长有害的代谢物在发酵液中大量积累的时期，此时α＞，出现微生物死亡、自溶，总细胞数呈负增长。

该阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。7、细胞生长动力学模型：

lnXtlnX0μt或lnNtlnN0μnt

Xt：培养时间t后的微生物细胞浓度，g/lX0：初始微生物浓度t：培养时间：比生长速率

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8、无抑制作用的细胞生长动力学Monod方程：

Monod发现细菌的比生长速率与单一限制性基质(growthlimitingnutrient)之间存在着一定模式关系（饱和双曲线函数），创建了生化工程中著名的Monod方程（1942年）。

μμmaxSt

KsStKS，底物亲和常数,与亲和力成反比。

其值越大，亲和力越低，比生长速率越小。当μ=1/2μmax，S=KS

Monod方程中单一限制性底物可以是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该基质相对贫乏，就成为限制性生长因子。实际过程中，可能出现多种限制性基质和抑制性物质，影响了Monod方程的适用性。（二）产物合成动力学：

Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成区分为三种类型：

类型Ⅰ∶也称为生长相关型（醇类、葡萄糖酸、乳酸）类型Ⅱ∶也称为生长部分相关型（柠檬酸、氨基酸）类型Ⅲ∶也称为非相关型（抗生素、酶、维生素、多糖）

Pint把其分为：生长偶联型和生长非偶联型。

①生长相关型：产物的生成与细胞的生长密切相关的动力学过程，产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果。即产物通常是基质分解代谢产物或合成细胞生长必须的代谢产物。代谢产物的形成和细胞的生长时同步的和完全偶联的，且产物的生成和底物的消耗有直接的化学计量关系。

②生长部分相关型：代谢产物是能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物。产物的生成与底物的消耗仅有时间关系，并无直接的化学计量关系，产物的生成与微生物生长部分偶联，属于中间发酵类型。③非生长关联性：产物的生成与能量代谢无关，与细胞生长也无直接关系，即产物的生成与微生物细胞的生长不偶联。产物为次级代谢产物。特点：细胞处于生长阶段，并无产物的积累，当细胞进入稳定期后，产物才开始大量生成。产物的积累之于细胞的积累量有关。1、

dPdXαβXdtdt16

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dP产物生成速率；dtα与菌体生长相关的产物生长系数；β与菌体密度相关的产物生长系数。α>0,β=0，生长偶联型

α>0,β>0，部分生长偶联型，混合型α=0,β>0，非生长偶联型（三）底物消耗动力学：

基质包括细胞生长与代谢所需的各种营养成分，其消耗分为三个方面：细胞生长，合成新细胞；细胞维持生命所消耗能量的需求；合成代谢产物。1、底物消耗动力学参数：底物比消耗速率，摄氧率。

底物比消耗速率：单位质量细胞在单位时间内底物消耗量。

底物消耗速率可通过菌体得率（生长得率）与菌体生长速率关联起来。底物比消耗速率：qS1μSμSmqS,maxm；YX/SKSSKSS单位体积培养液中的细胞在单位时间内摄取溶解氧的量称为摄氧率

（γ）或溶解氧的消耗速率（以Ro2表示）。比耗氧速率：qO2rO2X1r1XμXYX/OYX/O（四）分批发酵的分类对实践的指导意义：

如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。二、连续发酵动力学：

培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长

的发酵方式。

优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。

缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。1、连续发酵的类型：

恒化培养：使培养基中限制性基质的浓度保持恒定。恒浊培养：使培养基中菌体的浓度保持恒定。

加入新鲜培养基的同时，放出等体积的发酵液，获得连续发酵生产过程。分为单级和多级连续发酵。

恒化器：使培养液流速保持不变，微生物始终在低于其最高生长速率的条件下生长繁殖的连续培养装置,是一种通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的，因而可称为外控制式的连续培养装置。

在恒化器中:一方面菌体密度会随时间的增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低．两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。

恒浊器：根据培养器内微生物的生长密度，借助光电控制系统，控制培养液的流速，获得高菌体密度、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。

培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，通过光电控制系统的调节，促使培养液流速加快，反之亦然。微生物始终以最高生长速率生长

2、积累的细胞=(进入-流出)的细胞+(生长-死亡)的细胞

3、稀释率：单位时间内连续流入发酵罐中的新鲜培养基体积与发酵罐内培养液总体积的比值即为稀释率。D=F/V

稳态时，比生长速率等于比死亡速率，即比生长速率受稀释率的控制。4、积累的底物=（进入-流出）的底物-（生长+形成产物+维持代谢）消耗的底物

X=YX/S(Sin-Sout)

5、连续培养的菌体产率：Rcount=DX(1-tiii/T)

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Rcount为连续培养菌体得输出；DX为菌体产率；tiii为连续培养前（包括罐的准备、灭菌和分批培养前直到稳态）所需的时间；T为连续培养前到发酵稳态结束的时间。D为稀释率；X为菌体浓度。

6、杂菌积累速率=杂菌（流入流出）速率+杂菌生长速率

对于杂菌Y：在底物浓度为S时，杂菌Y的生长速率μY比系统的稀释速率D要小，dY/dt=μYYDY

3、影响因素：

①微生物本身遗传特征的影响；②培养基成分和浓度；

耗氧速率：油脂或烃类>葡萄糖>蔗糖>乳糖③菌龄；④发酵条件；⑤发酵类型；

三羧酸循环（TCA），呼吸强度高，耗氧量大，如谷氨酸、天冬氨酸；糖酵解途径（EMP），呼吸强度低，耗氧量小，如苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸。

4、控制溶解氧（DO;DissolvedOxygen)的意义：

◆溶解氧浓度影响细胞的生长和产物的合成，发酵的不同阶段对溶解氧浓度的要求不同；

◆了解菌体生长阶段和产物合成阶段的最适耗氧量，控制氧的供应，提高生产效率；

◆氧的溶解度低，导致了大量的浪费，提高传氧效率，降低空气的消耗量，降低设备和动力消耗，减少泡末的形成和染菌机会，提高设备利用率；二、发酵过程中氧的传递

传递途径：气相中氧的溶解、细胞内氧的利用；供氧和耗氧两方面。传递阻力

供氧阻力：气膜和液膜阻力；耗氧阻力：细胞团内与细胞膜阻力。

供氧：空气中的氧气从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。

耗氧：氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜扩散到细胞内。1、氧传递方程：

OTR=KLa(C*-CL)气液传质基本方程

OTR:单位体积培养液的氧传递速率KLa:以浓度差为推动力的体积溶氧系数C*:与气相中氧的分压平衡时氧的浓度

CL:液相中氧的浓度

若供氧速率大于需氧速率，即KLa(C*-CL)＞r，此时发酵液中溶解氧浓度CL会不断增加，趋近于C*。

若需氧速率大于供氧速率，则CL逐渐下降而趋向于零（尽管此时通气和搅拌可能仍在进行）。

2、要提高推动力，只能设法提高C*或减少CL影响推动力的因素：

温度:

溶质：电解质、非电解质、混合液溶剂：添加有机溶剂，增加氧的浓度氧的分压：增加罐压；提高氧分压提高氧饱和浓度（C*）：要提高C*，可降低培养温度、提高氧分压和降低培养基浓度等。

降低溶氧浓度（CL）：降低CL可通过减少空气流量等方法来达到，但溶氧浓度不能低于临解氧浓度。另外，减少空气流量本身会使KLa下降。3、影响发酵罐中Kla的因素KLa的准数关联式

设备参数：罐的形状、搅拌器的直径等

操作条件：表观线速度、功率、发酵液体积、搅拌转速等发酵液性质：密度、黏度、表面张力等4、搅拌的作用：

a把空气分散成小的气泡，增大液相的接触面积b产生涡流，延长气泡在液体中的停留时间

c造成湍流，减少气泡外滞留液膜的厚度，减小传递过程的阻力

d成分均匀分布，细胞均匀悬浮，有利于营养物质的吸收和产物的分散

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第八章发酵过程控制

发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。

发酵体系的特征：微生物细胞内部结构和代谢反应的复杂性；生物反应器环境的复杂性；系统状态的时变性及包含参数的复杂性。一、发酵过程控制概述1、发酵过程优化控制步骤

a确定能反应过程变化的各种理化参数及检测方法

b研究参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获得最佳范围和最适水平

c建立数学模型定量描述各参数随时间变化的量化关系，为发酵过程的优化控制提供依据。

d计算机在线自动化检测和控制2、发酵过程参数检测

发酵过程参数的检测是控制发酵过程的重要依据

检测方法

通过仪器在线检测发酵罐中取样离线检测常用的检测仪器在线检测：传感器

离线检测：分光光度计、气相和液相色谱仪等

3、直接状态参数：直接反应发酵过程中微生物生理代谢状况的参数对传感器的要求：耐高温、高压；避免表面被微生物堵塞有价值的状态参数：尾气分析和空气流量的检测间接状态参数：采用直接状态参数计算得到的参数

直接状态参数：温度、PH值、搅拌转速、液位、补料速率等间接状态参数：产物浓度、溶解氧、溶解CO2等4、离线发酵分析法

没有一种可在线监测培养基成分和代谢产物的传感器

发酵液的基质、前体、代谢产物和菌量的监测通过人工取样和离线分析缺点：不连贯性和滞后性5、发酵过程的代谢控制

a调节营养物质通过细胞膜进入细胞的能力b通过酶的定位限制与其他相应底物的接近c调节代谢流

调节酶的合成量,“粗调”调节酶的催化活力“细调”二、温度对发酵的影响及控制

发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。Q发酵=Q生物+Q搅拌+Q通气-Q蒸发-Q辐射

生物热：微生物在生长繁殖过程中，本身产生的大量热量。

用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动；合成产物；热能散发。生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。

搅拌热：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间、液体与设备之间的摩擦而产生的热。

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蒸发热：在发酵过程中以蒸汽形式散发到发酵罐的液面，再由排气管带走的热量。

辐射热：因罐内外温差，使发酵罐液中有部分热通过罐体向外辐射。在发酵罐上安装夹套或盘管调节：温度高时，通过循环冷却水控制；温度低时，通过加热使夹套或盘管中水的循环实现对温度的控制。1、温度对发酵的影响

A影响各种酶的反应速率和蛋白质性质；

B影响发酵液的物理性质：影响氧的溶解和传递；影响对基质的分解和吸收速；;

C影响生物合成的方向；2、微生物的适宜温度

多数微生物：20C-40C嗜冷菌：20C以下生长速率最大；嗜中温菌：30-35C嗜热菌：50C以上生长3、筛选高温菌株具有重要的实践意义

既可以减少杂菌的污染机会，又可减少由于发酵热及夏季培养所需的降温辅助设备和能耗。

4、温度和微生物生长的关系：一方面在其最适温度范围内，生长速度随温度升高的增加；另一方面，不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。5不同生长阶段的微生物对温度的反应不同

延迟期敏感最是温度附近缩短延迟期对数生长期最适范围内提高温度有利于生长生长后期：取决于溶解氧的浓度，提高通气量6、温度对基质消耗的影响

▲温度的变化影响基质消耗和比生长速率；

▲生产中，适当抑制生长(菌体的过量生长导致群体的退化和产率降低）；▲温度对产物合成影响不大时，适当提高温度抑制生长，有利于生产节能；7、温度对产物合成的影响▲影响各种反应速率

▲改变发酵液的物理性质，影响产物的合成▲影响生物合成的方向▲对代谢有调节作用

低温时，氨基酸合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制比正常温度时大，因此在抗生素发酵后期，降低温度，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭，转向目的产物的合成

例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。8、最适温度的确定

最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。

▲最适发酵温度的选择：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度。▲二阶段发酵

菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。▲其他发酵条件

通气条件较差时，最适发酵温度稍微低些，较低的温度下，氧的溶解度大，菌体的生长速率小，防止因通气不足造成的代谢异常。

培养基成分和浓度的影响：在使用基质浓度较稀或较易利用的培养基时，提高温度会使养料过早耗尽，导致菌丝自溶，发酵产量下降。9、变温培养

抗生素生产中，通过变温培养比恒温培养得到的产物多。最适温度的选择和控制，可有效的提高产物的产率。例如：

青霉素产生菌的最适生长温度是30℃，而最适于青霉素合成的温度是20℃。发酵过程中，在生长初期抗生素还未开始合成，菌丝还未长浓，这时的温度应适于微生物的生长；到抗生素分泌期，菌丝已长到一定浓度，积累抗生素是重点考虑，此时应满足生物合成的最适温度。三、pH对发酵的影响及控制

pH值变化的原因：微生物代谢活动分泌酸或碱性物质；利用培养基中的生

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理酸性盐或碱性盐。

1、几种抗生素合成的最适PH值链霉素、红霉素：中偏碱性6.8-7.4金霉素、四环素：5.9-6.33青霉素：6.5-6.8

2、pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响▲pH影响酶的活性

▲pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态

▲pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解

▲pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变

例如：黑曲霉在pH2-3时，发酵产生柠檬酸，在pH接近中性时，则产生草酸。

又如：丙酮丁醇发酵中，发酵后期pH为4.3-5.3时积累丙酮丁醇，pH升高则丙酮丁醇产量减少，而丁酸、乙酸含量增加。3、发酵过程中pH的变化及影响pH变化的因素▲发酵过程中pH的变化1）生长阶段

pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始pH而言）

如：利福霉素B发酵起始pH为中性，但生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解蛋白胨而生成铵离子，使pH上升至碱性；接着，随着铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产生的有机酸使pH下降到酸性范围。2）生产阶段

在生产阶段，pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围。3）自溶阶段

菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。▲引起发酵液中pH变化的因素

◇发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、培养基的组成和发酵条件。◇在菌体代谢过程中，菌体本身有建成其生长最适pH的能力，但外界条件发生较大变化时，pH将会不断波动。

◇引起pH下降的因素：碳源过量；消泡油添加过量；生理酸性物质的存在。◇引起pH上升的因素：氮源过多；生理碱性物质的存在；中间补料，碱性物质添加过多。

4、最适pH的选择

原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。

最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不同，这不仅与菌种特性有关，也取决于产物的化学性质。

例如：

一般产生碱性抗生素的，如灰色链霉菌生产链霉素、红色链霉菌产生红霉素，其合成产物的最适pH为6.8-7.3，中性偏碱；而产生两性抗生素的，如金色链霉菌生产金霉素，其合成产物的最适pH为5.9-6.3,弱酸性。应用：青霉素发酵：

通过调节加糖速率来控制pH值的方法，与恒速加糖和酸碱控制法相比，产量提高了1/4。链霉素发酵：

补充氨控制pH值，控制的同时补充了产物合成所需的氨。5、pH控制的常用方法①配制合适的培养基；

②加入非营养基质的酸碱调节剂；③加入基质性的酸碱调节剂；④加入生理酸性盐或碱性盐基质；

⑤把pH的控制和代谢调节结合，通过补料控制。6、pH值的具体调节方法：

1)添加CaCO3。采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用，剩下的酸根引起pH下降；有机酸发酵时形成钙盐沉淀。但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。

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2)氨水流加法3)尿素流加法

四、溶解氧对发酵的影响及其调控

微生物细胞耗氧状况：在线监测发酵液中溶解氧的浓度，了解氧的供需规律及其对微生物生长和产物合成的影响。在发酵罐内安装溶氧电极测定。

电极的要求：耐高温、高压、长时间灭菌以及具有长期的稳定性，精度和准确度±3%左右。1、发酵过程的溶氧变化：

◆发酵前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。◆在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。

◆补糖后，摄氧率就会增加，引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。

◆发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升。

2、发酵中溶氧异常下降的原因：

a污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗掉；b菌体异常代谢；

c设备或者工艺控制发生故障，搅拌速度明显下降、加消泡剂过多，引起溶氧下降。

3、发酵中溶氧异常上升的原因

菌体异常代谢，污染烈性噬菌体，菌体破裂后完全失去呼吸能力，溶氧就直接上升。

4、临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。

-2-5、氧的有害作用：形成新生O、超氧化物基O2或过氧化物基O2或羟自由

-基OH，破坏细胞及细胞膜。6、控制溶氧的作用：

◆判断操作故障或事故引起的异常现象◆判断中间补料是否恰当◆判断发酵体系是否污染杂菌◆控制代谢方向的指标

7、发酵过

程的溶氧变化

发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降

发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等

发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升。8、影响溶解氧的因素：

◆增加C*：提高氧分压、提高罐压、改变通气速率

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◆生产中提高KLa，改善设备的供氧能力；□增加通气量；□改善搅拌条件：改变搅拌器直径或转速；改变挡板的位置和数目。◆搅拌转速的影响◆发酵液黏度的影响◆培养基丰富程度的影响◆温度的影响

◆气体组成成分对DO值的影响五、CO2呼吸商对发酵的影响及调控

CO2对发酵影响的机理：CO2及HCO3-主要是影响细胞膜的结构，导致膜的流动性及表面电荷密度发生改变，影响到细胞膜的输送效率，导致细胞生长受到抑制、形态发生改变。培养液中的CO2主要作用于细胞膜的脂质核心部位；HCO3-影响细胞膜的膜蛋白。

1、呼吸商：生物体在同一时间内CO2产生量与O2的消耗量的比值叫做呼

吸商。

2、RQ可以反映菌的代谢情况：酵母发酵

RQ=1，糖有氧代谢，仅生成菌体，无产物形成；RQ>1.1，糖经EMP生成乙醇。

不同基质，菌的RQ不同

E.coli以延胡索酸为基质，RQ=1.44；以丙酮酸为基质，RQ=1.26；以琥珀酸为基质，RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖为基质，RQ分别为1.02和1.00。产物形成对RQ的影响较为明显，如产物还原性比基质大，RQ增加；产物氧化性比基质大，RQ就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。

实际生产中测定的RQ值明显低于理论值，说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和除葡萄糖以外的其他碳源。如发酵过程中加入消泡剂，由于它具有不饱和性和还原性，使RQ值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ值。

六、基质对发酵的影响

基质即培养微生物的营养物质。对于发酵控制来说，基质是生产菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度，是提高代谢产物产量的重要方法。补料控制目的

◆解除基质过浓的抑制◆解除产物的反馈抑制

◆解除葡萄糖分解代谢阻遏效应

◆避免在分批发酵中因一次性投糖（料）过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供氧不足的状况，通常采用中间补料工艺。补料的原则

◆控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。

◆为实现这一目标，在中间补料控制时，必须选择恰当的反馈控制参数和补料速率。七、通气搅拌对发酵的影响和控制

通气：供给微生物适量的无菌空气，满足菌体生长繁殖和积累代谢产物的需要氧传递速率的影响因素：搅拌器的形式、直径、组数、搅拌器间距和转速等。搅拌器的形式◆轴向式和径向式

轴向式：桨式、锚式、框式和推进式径向式：涡轮式

◆气液混合系统采用圆盘涡轮式搅拌器

特点：直径小、转速快、搅拌效率高、功率消耗低，产生径向液流，形成循环的翻腾，延长空气的停留时间

◆上组搅拌器：混合作用，采用平桨式◆下组搅拌器：打碎气泡，采用圆盘涡轮式搅拌转速和桨叶直径

◆低转速、大叶径或高转速、小叶径可达到同样功率

◆增大直径，利于液体混合；增大转速，提高溶氧水平，根据具体情况确◆定直径和转速

空气流量小、动力消耗小：小叶径和高转速；空气流量小、动力消耗大：直径影响不大；

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空气流量大、动力消耗小：大叶径和低转速；空气流量大、动力消耗大：小叶径和高转速非牛顿型发酵液：大叶径、低转速和多组搅拌器牛顿型发酵液：小叶径和高转速八、发酵过程中的泡沫及其控制泡沫产生的原因与机理：

◆由外界引进的气流因通气、搅拌被机械地分散形成；◆发酵过程中产生的气体聚结生成蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质存在

培养基中蛋白质以及微生物菌体等为起泡物质，具有稳定泡沫的作用培养基的成分、温度、酸碱度、浓度及泡沫的表面积对泡沫的稳定性都有一定影响。

泡沫对发酵的不利影响：

①降低了装料系数，降低设备的利用率；②增加了菌群的非均一性；③增加了染菌的机会；④导致产物的损失（逃液）；⑤消泡剂会给后提取工序带来困难。

1、发酵过程泡沫控制的方法：机械消泡法和化学消泡剂消泡。机械消泡法原理

靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。

方法：罐内消沫法；罐外消沫法。

优点：不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会缺点：不能从根本消除引起稳定泡沫的因素。化学消泡法机理

当泡沫表层存在由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度或加入某些具有强极性的物质，降低液膜强度，使泡沫破裂。

当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。八、高密度发酵：

九、发酵终点的判断与控制

判断标准：产品质量和经济效益。

发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大的影响

如果发酵时间太短，过多营养物质(如可溶性蛋白、脂肪等)残留在发酵液中，对下游操作提取、分离等工序都不利。

发酵时间太长，菌体会自溶，释放出菌体蛋白或体内的酶，又会显著改变发酵液的性质，增加过滤工序的难度，这不仅使过滤时间延长，甚至使一些不稳定的产物遭到破坏。都可能使产物质量下降，杂质含量增加，故要考虑发酵周期长短对提取工序的影响。

合理的放罐时间是由实验来确定的，即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产率和产品成本，采用生产率高而成本又低的时间，作为放罐时间。

不同发酵类型，达到的目标不同，对终点的判断标准也不同","p":{"h":15.839,"w":7.92,"x":1088.61,"y":481.138,"z":115},"ps":{"_enter":1},"t":"

位下跌，扰乱提取工段的作业计划。十、发酵过程的计算机控制原理

计算机对发酵的控制有开环控制系统和闭环控制系统。

开环控制：计算机只对被控制的对象输出数据和命令，不需要得到被控制对象反馈的信息。

闭环控制：一种具有双向控制的结构系统，即带有反馈的控制系统。计算机在发酵过程中的主要功能：过程数据记录，数据分析，过程控制。

第九章发酵罐的放大与设计

一、发酵罐的类型及结构

发酵罐的组成：包括釜体、搅拌装置、传热装置、轴封装置。釜体是由筒体和两个封头组成。

作用：为物料进行化学反应提供一定的空间。

搅拌装置是由传动装置、搅拌轴和搅拌器组成，作用：参加反应的各种物料均匀混合，使物料很好地接触而加速化学反应的进行。

发酵罐的特点：必须具备足够的强度、密封性、耐蚀性及稳定性。发酵罐的工作要求

清洁卫生；反应过程能保持恒定的温度，以利于发酵菌很好地进行发酵；搅拌器使物料混合均匀、加快反应速度、缩短发酵周期、强化传热；将发酵过程中产生的热量及时带走，保证反应正常进行。一、发酵罐的类型

1、通用式发酵罐：通用式发酵罐是指带有通气和搅拌装置的发酵罐，是工业生产中

最常用的发酵罐。其中，机械搅拌的作用是使发酵液充分混合，保持液体中的固性物料呈悬浮状态，并能打碎空气气泡以提高气液间的传氧速率。

2、气升式发酵罐：此类发酵罐是依靠无菌压缩空气作为液体的提升力，使罐内发酵

液通过上下翻动实现混合和传质传热过程。特点：结构简单、无轴封就，不易污染，氧传质效率高，能耗低，安装维修方便。

3、管道式发酵罐：是以发酵液的流动代替搅拌，依靠液体的流动，实现通气混合和

传质目的。尚处于试验阶段，对无菌要求不高的发酵可以考虑。4、固定化发酵罐：一种在圆筒形的容器中填充固定化酶或固定化微生物进行生物催

化反应的装置。优点：生物利用率高，主要有填充床和流化床两种。

5、自吸式发酵罐：是无需其他气源供应压缩空气的发酵罐，其关键部位是带有中央

吸气口的搅拌器。在搅拌过程中可以自吸入过滤空气，适合于耗氧很低的发酵类型。

6、伍式发酵罐：伍式发酵罐主要部位是套筒、搅拌器。搅拌时液体沿着套筒外向上

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升至液面，然后由套内返回罐底，搅拌器是用6根弯曲的中空不锈钢管焊于圆盘上，兼做空气分配器。无菌空气由空心轴导入，经过搅拌器甩出的液体混合，发酵液在套筒外侧上升，由套管内部下降，形成循环。多用于纸浆发酵液发发酵生产酵母。缺点：结构复杂，清洁套筒较困难，消耗功率高。二、发酵罐结构：

（1）外形、结构及几何尺寸

（2）搅拌装置

（3）挡板

挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。

全挡板条件：是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。

（4）空气分布装置

空气分布装置的作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。分布装置的形式有单管及环形管等。常用的分布装置是单管式，单管式管口对正罐底中央，装于最低一挡搅拌器下面，喷口朝下，管口与罐低的距离约40mm，并且空气分散效果较好。若距离过大，空气分散效果较差。该距离可根据溶氧情况适当调整。

空气由分布管喷出上升时，被搅拌器打碎成小气泡，并与醪液充分混合，增加了气液传质效果。环形管的分布装置，以环径di等于0.8Di（搅拌器直径）时最为有效。喷孔直径为5~8mm，喷孔直径向下，喷孔的总截面积约等于通风管的截面积。这种空气分布装置的空气分散效果不及单管式分布装置，喷孔容易被堵塞。（5）消泡器

破碎气泡；改善供氧；防止染菌。（6）发酵罐的换热装置夹套式换热装置

这种装置多应用于容积较小的发酵罐、种子罐；

夹套的高度比静止液面高度稍高即可，无须进行冷却面积的设计。

这种装置的优点是：结构简单；加工容易，罐内无冷却设备，死角少，容易进行清洁灭菌工作，有利于发酵。

其缺点是：传热壁较厚，冷却水流速低，发酵时降温效果差。

带夹套的发酵罐罐体壁厚要按外压计算[即0.3MPa（绝对压力）]夹套内设置螺旋片导板，来增加换热效果，同时对罐身起加强作用。三、通用式发酵罐的设计与放大

1、原则：是否适合生产工艺的放大要求以及获得最大的生产效率。考虑下列因素（1）微生物生长速率和产物转化率；（2）发酵罐的传递性能，包括传质效率、传热效率及其混合效率。

提高发酵罐的生产能力就是解决放大过程中出现的传递性能下降问题，即改善发酵罐的传质、传热和混合效果。2、设计的基本要求：适宜的径高比承受一定的压力

破碎气泡并混合良好，保证充足的溶解氧。良好的循环冷却和加热系统

内壁抛光，较少死角，易于彻底灭菌

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轴封严密，避免泄露能耗低，传递效率高具有机械消泡装置

安装必要的传感器和补料装置，提高发酵水平。四、发酵罐的放大设计单位相似原则：

放大准则：单位体积溶氧系数；单位体积功率；末端剪切力。放大方法：经验放大法；量纲分析法；时间常数法。经验放大法：几何相似法和非几何相似法电机的选配：

通常按照不通气的情况选择搅拌功率考虑启动因素

考虑减速传动装置的机械效率

高速小直径利于微观混合，但损伤大；低速大直径利于宏观混合，传递差。1-3.5kW/m3

第十一章发酵产物的提取与精制

发酵产物提取与精制的意义：实现发酵的最终目标获得高品质的产物；产物的提取和精制技术的进步以及工艺优化对上游提出新的技术和工艺改进要求，使下游的产物易于提取和精制，降低成本，提高竞争力。粗分离阶段

发酵结束后产物的提取和初步分离阶段，包括菌体和发酵液的固液分离、细胞破碎、目标产物的浸提、细胞浸提液或发酵液萃取、萃取液分离浓缩等纯化精制阶段

初步分离的基础上，采用特异性强、选择性高的分离技术，把目标产物和杂质分开，目标产物达到一定的要求

分离纯化条件：低温、适宜的PH值、尽可能小的剪切力、防止微生物和杂质污染；要求：快速操作、低温环境、温和条件、尽可能小的剪切力、防止污染、生物安全等；

关键：深入研究发酵体系特性和产物特点。一般的工艺流程：

四个阶段：发酵液的预处理和固液分离阶段、初步提取分离阶段、纯化精制阶段、成品加工阶段。

1、提取精制方法的优化与工艺设计

目标：产率高、成本低、品质优、操作简便、没有环境污染纯化方法的选择：离子交换法（用于蛋白质和酶分离纯化）各单元操作顺序

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注意：固液分离前进行发酵液预处理

一般情况下，收率高、纯度低的方法在前面；纯度高的方法在后面发酵产物分离纯化的操作顺序

固液分离；细胞破碎；目标产物的浸提或萃取；细胞液的浸提或发酵液的萃取液浓缩；柱色谱分离；结晶；干燥2、发酵培养物的特性①浓度低，处理体积大

②微生物细胞颗粒小，相对密度与液相相差不大③细胞含水量大，可压缩性大

④液体流变特性复杂，液相粘度大易吸附在滤布上，⑤产物性质不稳定3、预处理：

通过预处理，改变流体特性、降低滤饼比阻或离心沉淀特性、使发酵液相对纯化等提高固液分离效率、后续分离效率以及收率等

4、过滤特性的改变：降低发酵液粘度；添加絮凝剂；调整PH值；加入反应剂、助滤剂等。5、降低发酵液粘度

意义：滤液通过率饼的速率与粘度成反比，因此降低发酵液的粘度可以提高过滤效率

方法：加水稀释法、加热升温法、酶解法。⊙加水稀释法

优点：降低液体粘度

缺点：增加发酵液的体积，降低产物浓度，加大后续处理量。要求：稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比。⊙加热升温法

优点：降低液体粘度，提高过滤速率

注意：加热温度和时间控制在不影响产物活性的范围内；防止加热导致的细胞溶解，造成胞内物质外溢，增加产物分离纯化的难度。⊙酶解法

利用酶将发酵液中的多糖类物质，降解为寡糖或单糖，提高过滤效率一、凝聚与絮凝

原理：改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，凝聚成较大的颗粒，利于过滤。常用于菌体细小和粘度大的发酵液的处理。1、凝聚

定义：在中性盐的作用下，胶体粒子的双电子层排斥电位的降低，胶体体系不稳定出现聚集的现象。方法：加入电解质；

凝聚值：胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度；常用电解质：硫酸铝、氯化铁和氯化铝；2、絮凝

定义：在高分子絮凝剂的情况下，使胶粒形成絮凝团的作用。

絮凝剂的要求：分子必须含有相当多的活性官能团，能与胶粒表面结合；具有长链的线性结构，同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团；分子量不宜过大，以免影响溶解性。

原理：高分子聚合物，具有长链结构，链上有许多活性官能团，包括阴离子和非离子型基团，通过静电力、范德华力或氢键的作用，吸附在胶粒的表面。当高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面时产生架桥连接，形成较大的絮团，产生絮凝作用

种类：有机高分子类；无机高分子聚合物；天然有机高分子。

用量：通过实验确定。较多的絮凝剂有利于架桥充分，但过多引起吸附饱和，在胶粒上形成覆盖层，胶粒再次稳定。二、混凝

概念：同时包括凝聚和絮凝作用应用：

对于带电负荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可单独使用。

对于非离子型和阴离子型的高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键产生吸附架桥，所以它们常与无机电解质结合使用

加入蛋白质，悬浮粒子的双电层电位降低，凝聚成微粒再加入絮凝剂凝聚成较大颗粒

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祝大家考出好成绩，整理仓促，如有错误请原谅。

电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，提高了絮凝的效果，此时为混凝三、调整PH值⊙影响：

a电离度和电荷性质

b细胞、细胞碎片以及胶体物质在某PH时可能趋于絮凝而形成大颗粒，利于过滤

c改变某些物质的电荷性质，转入液相，减少膜过滤的堵塞和污染

四、加入反应剂：利用反应剂和某些可溶性盐生成不溶性沉淀，消除发酵液中杂质对过滤的影响。五、加入助滤剂

原理：在含有大量细小粒子的发酵液中加入助滤剂，助滤剂作为胶体粒子的载体，把粒子吸附在助滤剂的微粒上，均匀分布在滤饼层中，改变了滤饼的结构，降低滤饼的可压缩性，减小过滤阻力。

种类：硅藻土、珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素等使用方法：在过滤介质表面预涂助滤剂；直接加入到发酵液中两种方法同时用。六、发酵液相对纯化

对后提取分离影响最大的因素杂蛋白和高价无机离子杂蛋白的危害和去除方法

降低树脂的吸附能力；易产生乳化，使两相分离困难加热、有机溶剂去除七、高价无机离子的影响

干扰树脂对对活性物质的交换容量

常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，膜受到污染去除方法：

钙离子：草酸（注意回收）镁离子：草酸和三聚磷酸钠铁离子：黄血盐

第十五章发酵产品生产原理与技术运用

一、酒精

1、发酵菌种要求：高的发酵能力、高的比生长速率、高的耐酒精性。2、原料：

淀粉质原料：谷物原料和薯类原料；糖质原料：甘蔗和甜菜糖蜜；

纤维质原料：森林和木材工业下角料、秸杆、废纤维垃圾、甘蔗渣和玉米芯。3、酒精发酵生化机制

不同生产原料，酒精发酵生化过程不同。对糖质原料，可直接利用酵母将糖转化成乙醇。对于淀粉质和纤维质原料，首先要进行淀粉和纤维质的水解（糖化），再由酒精发酵菌将糖发酵成乙醇。4、原料预处理

淀粉质原料：糊化、糖化

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祝大家考出好成绩，整理仓促，如有错误请原谅。糖蜜：沉淀、离心分离、过滤纤维质原料：酸解、酶解

二、氨基酸类产品的发酵生产（自己总结）

三、青霉素（自己总结）

考试题型：

一、名词解释：5题10分二、填空题：40空20分三、选择题：20题20分祝大家考出好成绩，整理仓促，如有错误请原谅。

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祝大家考出好成绩，整理仓促，如有错误请原谅。32

四、判断题：10题10分五、简答题：6题30分六、综合题：1题10分

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